CNOT4-Mediated Ubiquitination of Influenza A Virus Nucleoprotein Promotes Viral RNA Replication

doi:10.1128/mBio.00597-17

.2017年5月23日；8（3）：e00597-17。

doi:10.1128/mBio.00597-17。

CNOT4介导的甲型流感病毒核蛋白泛素化促进病毒RNA复制

于振林¹, 金宋珍（King-Song Jeng）^1 2, 迈克尔·M·C·莱^三 4

附属公司

¹中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾。
²国家RNAi核心设施，中央研究院，台湾台北。
^三中国科学院分子生物学研究所，台湾台北michlai@gate.sinica.edu.tw。
⁴台湾台中中国医科大学中国医科大医院新兴病毒研究中心。

PMID： 28536288
预防性维修识别码：项目编号：5442456
内政部： 10.1128/生物.00597-17

CNOT4介导的甲型流感病毒核蛋白泛素化促进病毒RNA复制

于振林等。 mBio公司. 2017.

.2017年5月23日；8（3）：e00597-17。

doi:10.1128/mBio.00597-17。

作者

于振林¹, 金宋珍（King-Song Jeng）^1 2, 迈克尔·M·C·莱^三 4

附属公司

¹中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾。
²中国科学院国家RNAi核心设施，台湾台北。
^三中国科学院分子生物学研究所，台湾台北michlai@gate.sinica.edu.tw。
⁴台湾台中中国医科大学中国医科大医院新兴病毒研究中心。

PMID： 28536288
预防性维修识别码：项目编号：5442456
内政部： 10.1128/生物.00597-17

摘要

流感A病毒（IAV）RNA片段与病毒核蛋白（NP）和RNA聚合酶单独包装，形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合物。我们之前曾报道过NP是一种单泛素化蛋白，可以被细胞泛素蛋白酶USP11重泛素化。在本研究中，我们鉴定了一种E3泛素连接酶CNOT4（Ccr4-Not转录复合物亚基4），它可以泛素化NP。我们发现，IAV感染后，CNOT4敲除细胞中的病毒RNA、蛋白质、病毒颗粒和RNA聚合酶活性水平低于对照细胞中的水平。相反，CNOT4的过度表达挽救了病毒RNP活性。此外，CNOT4与细胞内的NP相互作用。一个在体外泛素化试验还表明，NP可以通过在体外-翻译的CNOT4，但泛素化并不影响NP的蛋白质稳定性。值得注意的是，CNOT4增加了NP泛素化，而USP11降低了NP的泛素化。泛素化NP的质谱分析显示NP的各种赖氨酸残基上有多个泛素化位点。其中三个是K184、K227和K273，位于NP的RNA-结合沟上。这些位点突变为精氨酸会降低病毒RNA的复制。这些结果表明，CNOT4是NP的泛素连接酶，NP的泛素化在病毒RNA复制中起积极作用。重要性流感病毒，特别是甲型流感病毒，在人类和禽类中引起严重和频繁的疫情。从公共卫生的角度来看，寻找抗病毒药物的潜在靶点至关重要。我们之前发现病毒核蛋白（NP）是泛素化的，泛素化增强了病毒RNA的复制。在本研究中，我们发现了一种细胞泛素连接酶CNOT4，能够泛素化NP。泛素化位点分散在NP分子的表面，这对RNA复制至关重要。CNOT4和泛素蛋白酶USP11共同调节NP泛素化的程度，从而调节RNA复制的效率。因此，这项研究确定了一个潜在的抗病毒靶点，并揭示了一种新的调节病毒复制的翻译后机制。这是流感病毒研究文献中的一项新发现。

关键词：CNOT4；IAV；NP；RNA复制；甲型流感病毒；核蛋白；无处不在。

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图1
CNOT4基因敲除抑制IAV复制。（A）二次RNAi筛查的免疫荧光分析。A549细胞被各种shRNA-harbocing慢病毒转导，这些慢病毒针对初级混合shRNA文库筛选中确定的不同基因（19）。然后将转导的细胞以1的MOI感染WSN/33病毒。在p.i.第6小时，使用NP抗体和DAPI对细胞进行免疫荧光染色。NP-DAPI的强度被用作指标，并进行归一化以控制shLacZ染色强度，以估计感染IAV的细胞百分比。（B和C）CNOT4敲除效率（B）和相对病毒NP RNA水平（C）通过qRT-PCR，使用来自不同CNOT4击倒A549细胞（shRNA克隆CN1至CN5）的RNA，在6 h p.i.（平均值±SD，n个= 4). *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*<0.001，基于Dunnett多重比较测试的单向方差分析。（D）用抗NP抗体在p.i.6 h通过免疫印迹法检测病毒蛋白。肌动蛋白被用作内部控制。（E）通过MDCK细胞上的斑块试验，在24小时p.i.测定释放到培养基中的子代病毒的病毒滴度（平均值±SD，n个= 3). ***,*P（P）*<0.001，基于Dunnett多重比较测试的单向方差分析。

图2
病毒RNP活性与CNOT4的表达水平相关。（A） CNOT4敲除细胞RNP活性的微复制子分析结果。用用于表达病毒PB1、PB2、PA和NP的质粒和表达反义萤光素酶基因的报告质粒转染两个shCNOT4克隆，CN1和CN3，以及对照shLacZ 293T细胞，如其他地方所述，用于微小复制子测定（29）。转染后24小时，测定荧光素酶活性，并将其归一化为对照shLacZ的反应（平均值±SD，n个= 3). **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*<0.001，通过单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验。（B） 293T细胞中CNOT4的敲除效率。（C）过度表达CNOT4可增强病毒RNP活性。将CNOT4敲除（shRNA克隆CN1和CN3）或对照细胞（shLacZ）与野生型CNOT4亚型e（CNe）或其摆动突变体（wCNe）一起转染，并用于微复制子分析。按照面板A所述测量相对荧光素酶活性（平均值±SD，n个= 3). ***,*P（P）*<0.001（与shLacZ相比）；##，*P（P）*< 0.01; ###,*P（P）*<0.001（相对于shRNA克隆CN1或CN3），基于Tukey多重比较检验的单因素方差分析。（D）免疫沉淀（IP）分析中CNOT4与病毒RNP成分的相互作用。用标记的CNOT4亚型e（CNe-Flag）和一种HA标记的病毒蛋白（PB1、PB2、PA和NP）共同转染293T细胞。在转染后48小时，使用Flag-agarose沉淀细胞裂解物。蛋白用抗HA和抗Flag抗体进行免疫印迹（IB）观察。

图3
CNOT4增强了病毒NP泛素化，而氘激酶USP11降低了它。（A）CNOT4的敲除/过度表达与病毒NP的泛素化相关。用Ub-myc和NP-HA转染CNOT4敲除（shCNOT4克隆）或对照shLacZ 293T细胞，转染或不转染野生型（CN）或摇摆突变型（wCN）CNOT4e-Flag。使用HA-淀粉对细胞进行免疫印迹（IB）。用抗HA和抗myc抗体观察免疫沉淀蛋白。实心箭头表示单泛素化NP。箭头表示为质谱分析切割的蛋白质带（见图5）。（B） CNOT4和USP11对病毒NP泛素化有相反的作用。如图所示，用NP-HA、Ub-myc、CNOT4e-Flag和USP11共同转染CNOT4敲除或对照shLacZ 293T细胞，并用HA-agarose进行免疫印迹。用抗NP和抗myc抗体观察免疫沉淀的蛋白质。凝胶下方显示了每个样品中单泛素NP（箭头）的相对含量。

图4
病毒NP被CNOT4泛素化*在体外*，其泛素化不会导致NP降解。（A）体外NP、CNOT4和p53的转录/翻译。携带NP-HA、CNOT4e-Flag或p53-HA开放阅读框的质粒与TNT裂解物在30°C下孵育1 h以合成目标蛋白。使用抗HA抗体（针对p53和NP）或抗Flag抗体（针对CNe）通过Western免疫印迹（IB）检测样品。各蛋白质产品用箭头表示。（B）体外NP与CNOT4 E3连接酶泛素化分析结果。体外-如面板A所述，获得翻译的NP-HA和p53-HA TNT裂解物，并使用泛素化试剂盒进行培养*在体外*-在37°C下翻译CNOT4-标记1小时。然后使用抗HA抗体通过免疫印迹检测泛素化蛋白。箭头表示无泛素化的主要蛋白质产品。垂直线表示泛素化蛋白质。（C） NP蛋白稳定性分析。用表达NP-HA的质粒转染293T细胞，转染时可携带或不携带CNOT4e-Flag。转染后24小时，细胞在裂解前用环己酰亚胺（50μM）和MG132（10μM）处理指定的时间长度。每个样品中NP的相对量显示在凝胶下方。

图5
泛素化NP的MS/MS分析显示了多个泛素化位点。由泛素化NP衍生的多肽的串联质谱显示，泛素在不同的泛素残基上与双Gly修饰的泛素结合。如图3所示分离泛素化NP，并使用抗HA–琼脂糖从转染NP-HA或Ub-myc（有或没有CNOT4e-Flag）的293T细胞中分离。从指示的蛋白质带中切下蛋白质样品（如图3所示）并进一步纯化（见材料和方法）。样品通过MS分析进行分析。使用吉祥物搜索引擎，搜索标记为LeuArgGlyGly（K_LRGG公司)或GlyGly（K_GG公司). 在K31（A）、K77（B）、K87（C）、K91（D）、K113（E）、K184（F）、K227（G）、K299（H）、K273（I）和K351（J）残留物中观察到GG或LRGG修饰。

图6
赖氨酸-精氨酸突变NP的病毒RNP活性及其与结构的关系；该图显示了赖氨酸残基在NP的RNA-结合沟中的重要性。（A）在缺乏或存在外源CNOT4的情况下，各种赖氨酸-精氨酸突变体的RdRp活性。如图2所示，对NP的不同赖氨酸突变体进行微复制子分析。转染后24小时测定荧光素酶活性，并将其归一化为对照组的WT NP。NP水平（黑柱）表示在没有外源性CNOT4的情况下，RdRp的基本活性；NP和CN水平（灰色柱）表明CNOT4过度表达细胞中的RdRp活性。红色星号表示KR突变体的RdRP活性显著低于野生型NP突变体；它们用绿色方框进一步突出显示。黑色星号表示在CNOT4过度表达的情况下，KR突变体的RdRP活性显著高于野生型NP。黑色#符号表示其RdRP活性被CNOT4增强到统计学显著水平的突变体（平均值±SD，n个= 3). *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*<0.001（与WT NP相比）。#，*P（P）*< 0.05; ###,*P（P）*<0.001（与KR-NP相比），基于Tukey多重比较测试的单向方差分析。（B） NP分子上关键赖氨酸残基的位置。A型流感病毒NP的三维结构是根据Chenavas等人（44）的描述进行修改的。K184、K227和K273位于NP的RNA-结合槽中（蓝色表示正电荷）；K91和K351位于NP表面。

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