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.2017年7月；16(1):215-223.
doi:10.3892/mmr.2017.6609。 Epub 2017年5月19日。

脑死亡兔肾脏差异表达蛋白的蛋白质组学分析

凌莉 1, 李宁 1, 何崇祥 1, 魏黄 1, 范晓丽 1, 钟子彪 1, 王岩峰（Yanfeng Wang） 1, 齐发叶 1
附属公司

脑死亡兔肾脏差异表达蛋白的蛋白质组学分析

凌莉等。 分子医学代表. 2017年7月.

摘要

之前的大量临床研究报告称，与活体亲属或尸体器官移植相比，脑死亡供体的移植功能延迟。然而，目前还没有准确的方法来评估脑死亡供体肾脏的质量。在本研究中，进行了二维凝胶电泳和基于MALDI‑TOF MS的比较蛋白质组分析，以分析脑死亡和对照组肾组织之间差异表达的蛋白质。共有40只年龄和性别匹配的兔子被随机分为脑死亡后捐赠组（DBD）和对照组。在通过颅内进行性压力诱导脑死亡后，分别于2小时、6小时和8小时测量肾功能和形态学改变。脑死亡后6小时，从肾脏组织学证据中检测差异表达蛋白。尽管在双向凝胶电泳中，对照组和DBD组分别鉴定出904±19和916±25个蛋白点，但MALDI‑TOF MS鉴定出了>2倍的变化，并通过NCBI数据库进行了搜索。作者成功获得了五种下调蛋白，分别是：Prohibitin（亚型CRA_b）、β-1,3‑N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1、Annexin A5、超氧化物歧化酶（线粒体）和细胞色素b‑c1复合物亚基1（线粒体前体）。相反，其他五个上调的蛋白质是：含有A的PRP38前‑mRNA处理因子38（酵母）结构域、钙调神经磷酸酶亚基B 1型、V‑型质子ATP酶亚基G 1、NADH脱氢酶[泛醌]1β亚复合物亚基10和过氧化物酶原‑3（线粒体）。免疫组化结果显示，禁令蛋白（PHB）的表达呈时间依赖性逐渐增加。结果表明，脑死亡患者肾脏中的几种蛋白质水平发生了变化，即使主要功能和形态学变化不明显。因此，PHB可能是脑死亡供体肾脏初级质量评估的新生物标记物。

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数字

图1。
图1。
脑死亡对脑死亡诱导后8小时内血清BUN和Cr水平变化的影响。使用自动生化分析仪测量脑死亡后2、6和8小时，对照组和DBD组的血清BUN和Cr水平。（A） 对照组和DBD组与其他组相比均无明显变化。（B） 在DBD组中，与对照组或前一组相比，Cr水平随着时间的推移显著升高（2小时除外）（n=5；*P<0.05，与前一时间点（2小时）组相比；∆与对照组相比P<0.05）。BUN，血尿素氮；Cr，肌酐；DBD，脑死亡后捐赠。
图2。
图2。
脑死亡诱导后8小时以上，脑死亡对肾脏形态学改变的影响。对照组和DBD组的肾细胞用苏木精和伊红染色（放大×200）。（A-C）对照组2、6和8小时的时间点，肾细胞排列整齐，染色均匀。肾小球和肾小管结构正常。（D-F）DBD组2、6和8小时的时间点，其中2小时肾小球和近曲小管的结构与对照组l相比大致正常。DBD组6小时时，一些小管出现明显变性和细胞水肿。观察到肾细胞液泡变性和近曲小管阻塞。DBD组8小时时，肾小管细胞在大多数区域表现出明显的细胞水肿和明显的炎症（n=5）。DBD，脑死亡后捐赠。
图3。
图3。
使用二维电泳凝胶对对照组和DBD组的差异蛋白表达谱进行分析。所有样品在第一维用等电聚焦，在第二维用SDS-PAGE分离。使用PD-Quest 2D分析软件分析考马斯亮蓝染色的凝胶。（A） 通过Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS串联质谱分析（用数字标记），共鉴定出42个差异表达点中的10个。（B） DBD组和对照组差异表达蛋白的部分扩增（1-10；n=5）。
图4。
图4。
使用MALDI-TOF串联质谱鉴定PHB、SOD2和UQCRC1蛋白表达的变化。获取的光谱在基于Swiss-Prot蛋白质数据库的吉祥物搜索引擎中搜索。（A） 肽209的m/z 1396.8前体离子的MS/MS光谱具有相应的峰值，被鉴定为禁止。（B） 肽135的m/z 1729.2前体离子的MS/MS光谱具有相应的峰值，被鉴定为超氧化物歧化酶。（C） 肽229的m/z 2726.9前体离子的MS/MS谱具有相应的峰值，鉴定为细胞色素b-c1复合物亚基1。
图5。
图5。
使用蛋白质印迹分析对3种典型蛋白质进行重新鉴定。（A） 配对DBD和对照样品中PHB的代表性结果在不同时间点呈现表达水平。与对照组相比，DBD组的PHB表达在8 h时显著增加。在每个时间点，DBD和对照组之间都存在统计差异。（B） SOD2在配对DBD和对照样品中的代表性结果显示其在不同时间点的表达水平。与DBD组相比，对照组在8 h时的表达显著下降。在2 h和6 h时，DBD组与对照组之间存在统计差异。（C） UQCRC1在配对DBD和对照样品中的代表性结果在不同时间点显示差异表达。在每个时间点，DBD组和对照组之间都存在统计差异。（D） 成对DBD组和以β-肌动蛋白作为内部对照的对照样品中PHB、SOD2和UQCRC1的蛋白质印迹分析的代表性结果*与之前时间点组相比P<0.05；∆与对照组相比，P<0.05。PHB，禁止；DBD，脑死亡后捐赠；SOD2，超氧化物歧化酶；UQCRC1，细胞色素b-c1复合物亚单位1，线粒体前体。
图6。
图6。
通过免疫组织化学重新鉴定交替PHB蛋白。（A-C）配对DBD组和（D-F）对照样品的免疫组织化学分析的代表性图像（放大倍数，×400）。（A-C）PHB蛋白在肾小管上皮细胞胞浆中呈黄棕色颗粒，在对照组肾组织中表达。（D-F）DBD组肾组织中PHB蛋白染色的表达随着时间的推移而增加，并在脑死亡后8小时达到峰值。在脑死亡后2、6和8小时，与对照组相比，各DBD组细胞质中PHB的表达明显增加。PHB，禁止；DBD，脑死亡后的捐赠。
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