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.2017年5月18日;66(4):517-532.e9。
doi:10.1016/j.molcel.2017.04.027。

溴代体蛋白BRD4是一种自噬和溶酶体功能的转录抑制因子

附属公司

溴胺蛋白BRD4是自噬和溶酶体功能的转录抑制因子

Jun-Ichi Sakamaki公司等。 分子电池. .

摘要

自噬是一种膜运输过程,引导溶酶体中细胞质物质的降解。这个过程促进了细胞的保真度,虽然自噬的核心机制是已知的,但促进和维持自噬机制的定义还不太明确。在这里,我们报告了表观遗传读取器BRD4和甲基转移酶G9a抑制TFEB/TFE3/MITF非依赖性转录程序,该转录程序促进自噬和溶酶体生物发生。我们表明,BRD4基因敲除在体外和体内诱导自噬,以应对某些情况,但不是所有情况。在饥饿的情况下,涉及AMPK和组蛋白去乙酰化酶SIRT1的信号级联取代染色质结合的BRD4,促使自噬基因激活和细胞存活。重要的是,这个程序是独立的,也与BRD4的促生长特性相互作用,并被NUT中线癌的驱动因素BRD4-NUT有效抑制。因此,这些发现确定了一种独特的选择性自噬调节机制。

关键词:AMPK;BRD4;BRD4-NUT;G9a/EHMT2/KMT1C;SIRT1;自噬;hMOF/KAT8;溶酶体;选择性自噬;自噬的转录调控。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
BRD4沉默增强自噬通量(A)果蝇属S2R公司+用靶向控制荧光素酶(Luc)或Fs(1)的双链RNA(dsRNA)转染表达GFP-LC3的细胞。用对照或BRD4 siRNA转染72小时的(B和C)KP-4细胞进行western blot分析(B),并对LC3B(C)进行染色。显示了归一化为单元数的LC3穿孔数。CON:n=94个细胞,BRD4 1:n=97个细胞,BR D4 2:n=74个细胞。比例尺,50μm。(D) 携带可诱导肾素荧光素酶或BRD4 shRNA转基因小鼠小肠切片的免疫组织化学。切片染色LC3(上部)和BRD4(下部)。BRD4板中的细胞质信号是由于非特异性染色引起的。比例尺,50μm。(E) 用10μM CQ处理转染BRD4 siRNA的KP-4细胞4小时。(F) 转染BRD4 siRNA的KP-4细胞进行WIPI2染色。显示了归一化为单元格编号的WIPI2点的数量。CON:n=119个细胞,BRD4 1:n=107个细胞,BR D4 2:n=109个细胞。比例尺,20μm。(G) 用BRD4 siRNA转染稳定表达RFP-GFP-LC3的KP-4细胞。比例尺,50μm。(H) 在有或无CQ的情况下,用500 nM JQ1处理KP-4细胞9小时(10μM,4小时)。(一) 用10μM CQ处理过度表达BRD4的KP-4细胞4小时。(J) 用10μM CQ处理转染NUT siRNA 5天的TY-82细胞8小时。使用NUT抗体检测BRD4-NUT。所有数据均显示为平均值±SD。p<0.01。另请参见图S1。
图2
图2
BRD4是自噬基因表达的负调控因子(a和B),用对照或BRD4 siRNA转染KP-4细胞,进行RNA-seq和基因本体分析(a)和RT-qPCR分析(B)。(C) 用DMSO、500 nM JQ1、500 nM-I-BET151或500 nM OTX015处理KP-4细胞9小时的RT-qPCR分析。(D) 用500 nM JQ1处理KP-4细胞指定时间的RT-qPCR分析。(E) 过表达BRD4的KP-4细胞的RT-qPCR分析。所有数据均以平均值±SD表示。在(A)–(D)中,n=3个独立实验;在(E)中,数据代表了一式三份的两个独立实验。p<0.01,∗∗p<0.05。另请参见图S2。
图3
图3
BRD4敲除增强溶酶体功能(A)用对照或BRD4 siRNA转染KP-4细胞的RT-qPCR分析。(B–D)用溶酶体蛋白抗体(B)对转染BRD4 siRNA的KP-4细胞进行western blot分析,并用LAMP1抗体(C)、溶酶体追踪红(100 nM,2小时)(D,上面板)、,和魔术红CTSB(1小时)(D,下部面板)。LAMP1面积+、LysoTracker+和魔法红CTSB+显示了归一化为单元数的区域(C,CON:n=115个单元,BRD4:n=130个单元;D上部,CON:n=66个单元,BRED4 1:n=52个单元,BR D4 2:n=50个单元;C下部,CON:n=164个单元,BD4 1:n=109个单元,FRD4 2:n=53个单元)。比例尺,50μm。(E) 使用来自对照细胞和BRD4敲低KP-4细胞的裂解物测量己糖胺酶活性。对转染NUT siRNA 72小时(F)或经500 nM JQ1处理9小时(G)的TY-82细胞进行(F和G)RT-qPCR分析。(H) 用BRD4和/或MiT/TFE(TFEB,TFE3,MITF)siRNA转染KP-4细胞,并用10μM CQ处理4小时。所有数据均显示为平均值±标准偏差。在(A)和(F)中,n=3个独立实验。在(E)中,n=4个独立实验。在(G)中,数据代表了一式三份的两个独立实验。p<0.01,∗∗p<0.05。另请参见图S3。
图4
图4
饥饿导致BRD4从自噬基因启动子(A和B)解离KP-4细胞饥饿4小时,然后用BRD4抗体进行染色质免疫沉淀(ChIP)分析(A)和RT-qPCR分析(B)。(C) 用BRD4抗体对感染Cas9/hMOF sgRNA的KP-4细胞进行ChIP检测。(D) KP-4细胞饥饿4小时,然后用H4K16Ac抗体进行ChIP检测。感染Cas9/SIRT1 sgRNA的(E和F)KP-4细胞饥饿4小时,然后用BRD4抗体(E)和RT-qPCR分析(F)进行ChIP分析。Western blot显示Cas9/SIRT1 sgRNA-感染细胞中SIRT1有效缺失。感染Cas9/AMPKα1和α2 sgRNAs的(G和H)KP-4细胞饥饿4小时,然后用DBC1抗体(G)免疫沉淀和RT-qPCR分析(H)。所有数据均显示为平均值±SD。在(A)–(F)和(H)中,n=3个独立实验。p<0.01,∗∗p<0.05,无显著性差异。另请参见图S4。
图5
图5
BRD4通过G9a(A)抑制自噬基因的表达。KP-4细胞的细胞提取物经过G9a抗体(上部)和BRD4抗体(下部)免疫沉淀。(B) KP-4细胞饥饿4小时,然后用BRD4抗体免疫沉淀。用500 nM JQ1处理(C–F)KP-4细胞9小时(C和E)。用500 ng/mL多西环素(DOX)处理含有可诱导对照或BRD4 shRNA的KP-4细胞4天(D和F)。使用G9a(C和D)和H3K9diMe(E和F)抗体进行ChIP分析。感染靶向G9a的shRNA的(G和H)KP-4细胞转染BRD4 siRNA,然后进行RT-qPCR(G)和western blot(H)。(一) 过度表达BRD4的KP-4细胞被靶向G9a的shRNA感染。所有数据均显示为平均值±标准偏差。在(C)–(G)中,n=3个独立实验。p<0.01,∗∗p<0.05,无显著性差异。另请参见图S5。
图6
图6
BRD4沉默对刺激依赖性和选择性自噬(A–F)细胞的影响转染BRD4 siRNA的细胞饥饿1–5小时(KP-4细胞,A),用500 nM雷帕霉素处理24小时(KP-4cells,B),饥饿葡萄糖4小时(KP-40cells,C),缺氧培养(1%O)2)条件为48小时(SUIT2细胞,D),用100 mM海藻糖处理4小时(KP-4细胞,E),或用500 nM 4-羟氨苄(4-OHT)处理48小时(IMR90 ER-HRas G12V细胞,F)。(G) 用BRD4 siRNA转染携带rtTA和Tre-ight-HTT Q94-CFP的KP-4细胞。转染后12小时,用1μG/mL DOX处理细胞10小时。去除DOX后48小时,将细胞分离成Triton X-100可溶和不可溶部分。(H) 转染BRD4 siRNA的KP-4细胞感染肠炎沙门氏菌鼠伤寒血清型。的数量沙门氏菌通过在感染后2、6和8小时进行克隆形成单位分析确定,并在2小时时将其归一化。数据显示为平均值±SEM;n=4个独立实验。(I) 用BRD4 siRNA转染表达YFP parkin的KP-4细胞,然后用1μM抗霉素A和1μM寡霉素处理8小时。另请参见图S6。
图7
图7
BRD4敲除在饥饿期间维持mTOR活性,并对饥饿诱导的细胞死亡(A和B)产生抵抗力。转染BRD4 siRNA的KP-4细胞缺乏氨基酸(A)。用CQ(10μM,4小时)预处理的细胞在CQ(B)存在下经受氨基酸饥饿2小时。(C) 感染Cas9/ATG5 sgRNA的KP-4细胞转染BRD4 siRNA,并进行氨基酸饥饿2小时。用BRD4 siRNA转染感染Cas9/ATG5 sgRNA的(D和E)KP-4细胞。饥饿48小时后,测定亚G1细胞的百分比(D)和细胞数(E)(n=3个独立实验)。转染BRD4 siRNA的(F和G)KP-4细胞在10μM CQ存在或不存在的情况下饥饿48小时。通过台盼蓝排除试验测定死亡(F)和存活(G)细胞的百分比(n=4个独立实验)。所有数据均显示为平均值±SD。p<0.01,无显著性差异。另请参见图S7。

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