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.2017年5月3日10:116。
doi:10.3389/fnmol.2017.00116。 2017年电子收集。

神经鞘磷脂1的可溶性外体通过激活代谢性谷氨酸受体2降低突触活性

米歇尔·德·格伦德 1 2, 伊娃·M·卡尔森 2, 安德烈亚斯·博尼格 1, 奥克萨纳·德米特里瓦 1, 安德斯·彼得森 2, 雅各布·雅各布森 三, 弗拉基米尔·贝雷津 2, Jean-François Perrier女士 2, 西尔维娅·欧扎雷克 1
附属公司

神经鞘磷脂1的可溶性外体通过激活代谢性谷氨酸受体2降低突触活性

米歇尔·德·格伦德等。 前臼齿神经科学. .

摘要

突触细胞粘附分子是神经元活性依赖性蛋白水解的重要靶点。突触后神经原（NLs）与突触前神经递质（NXs）形成跨突触复合物。金属蛋白酶以活性依赖的方式将NX和NL从细胞表面裂解，释放可溶性细胞外片段和膜栓系C末端片段。NL1的分裂抑制了突触传递，但其发生机制尚不清楚。代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）主要位于突触前终末的外围，在那里它们抑制环磷酸腺苷（cAMP）的形成，从而抑制谷氨酸的释放并减少突触传递。在本研究中，我们发现NL1的可溶性胞外域与神经元和异源细胞中的mGluR2结合并激活，导致cAMP形成减少。在小鼠海马的切片制备中，NL1抑制了投射到CA3锥体神经元的苔藓纤维中谷氨酸的释放。当存在选择性mGluR2拮抗剂时，NL1的突触前效应被消除。因此，我们的数据表明，NL1的可溶性胞外结构域在功能上与mGluR2相互作用，从而降低突触强度。

关键词：细胞粘附分子；海马体；蛋白水解；突触活动。

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数字

图1
图1
可溶性神经胶质蛋白1（NL1）胞外域通过激活代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）降低环磷酸腺苷（cAMP）水平。（A）可溶性NL1降低神经元中的cAMP水平。海马神经元生长7天，然后用8μM forskolin和不同浓度的重组外核白细胞介素1处理20分钟。谷氨酸作为阳性对照。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验确定统计显著性*第页=0.0344, **第页= 0.01;n个= 3–7.（B）NL1通过激活mGluR2降低cAMP水平。海马神经元生长7天，然后在指定浓度的非竞争性mGluR2抑制剂RO 64-5229存在下，仅用8μM forskolin（黑条）或forskolin-重组外NL1（灰条）处理20分钟。使用Friedman检验和Dunn多重比较检验确定统计显著性*第页=0.0316，n个= 4.（C）可溶性NL1激活mGluR2并降低cAMP水平。用mGluR2-绿色荧光蛋白（GFP；黑条）或空载体（灰条）转染HEK-293细胞，然后用8μM forskolin和重组外核NL1处理20分钟。使用Kruskal-Wallis试验和Dunn多重比较试验确定统计显著性*第页=0.0049;n个= 5.（D）用mGluR2-GFP和NL1B-HA双重转染HEK-293细胞，然后仅用8μM forskolin处理。使用Mann-Whitney检验确定统计显著性*第页=0.0286;n个= 4. 结果表示为相对于未处理对照（设定为100%）的百分比±SEM。
图2
图2
NL1与mGluR2相互作用。（A）NL1从全脑裂解物（P4–5）中免疫沉淀，并用mGluR2/3抗体探测（免疫印迹[WB]）。山羊正常血清作为阴性对照（IgG）。mGluR2/3的免疫印迹显示单体（100kDa）和二聚体（约200kDa。NL1的免疫印迹也产生了全长蛋白（110kDa）和可溶性胞外域（约90kDa）的两条带。（B）用带有或不带有剪接位点A或B的HA-tagged NL1和strep-taged mGluR2表达载体转染HEK-293细胞。蛋白质复合物被免疫沉淀（IP）并用指示的抗体进行探测（WB）。小鼠IgG作为阴性对照。所有的羟基磷灰石都来自同一个膜。110和90kDa处的条带分别代表HA-NL1全长和可溶性胞外域，100和200kDa处的条带分别代表mGluR2单体和二聚体。（C、D）定量转染HEK-293细胞的免疫沉淀NL1。条形图表示定量免疫印迹信号(n个= 3). 所有的羟基磷灰石都来自同一个膜。（E）用不含剪接位点A或B的HA标记的NL1或不含AChE同源域（∆ACh）的HA标记NL1和链球菌标记的mGluR2表达载体转染HEK-293细胞。（上面板）用所示抗体（HA、strep或IgG）免疫沉淀（IP）含有mGluR2和HA-NL1或mGluR2和HA-∆ACh的蛋白质复合物，并用抗HA抗体探测（WB）。110和90 kDa的带分别代表HA-NL1全长和可溶性外结构域，30 kDa带代表HA-∆ACh。小鼠IgG作为阴性对照。HA-blots来自同一膜。（下面板）为了确认mGluR2在HEK细胞中的表达，对含有mGluR2和HA-NL1（NL1）或mGluR2和HA-∆AChE（∆ACh）的蛋白复合物进行免疫沉淀（IP），并用抗链球菌抗体进行探针（WB）。100和200 kDa的带分别代表mGluR2单体和二聚体。
图3
图3
NL1外结构域在CA3神经元中产生突触前抑制。 （A）准备示意图。在电压灯模式（Vh=−70 mV）下记录海马CA3神经元的全细胞形态。苔藓纤维的突触刺激是通过双极电极（红色）、贴片电极（黑色）和局部喷施外源性NL1（绿色）产生的。N个-AP5（50μM）阻断了甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体。氢溴酸盐SR 95531（加巴静；10μM）阻断GABA受体。（B–E）CA3神经元在控制条件下（黑色）和在记录的神经元顶端树突附近（绿色）膨化外-NL1后对两种刺激（S1和S2）的反应。（C）第一个EPSC的振幅从−294.6±13.20降至−191.1±12.46 pA(****第页<0.0001，未配对t吨-测试；n个=30次扫描）。（D）第二个EPSC的振幅也降低，但幅度较小（从−353.4±12.18降至−301.1±10.47 pA**第页=0.0019，未配对t吨-测试；n个=30次扫描）。（E）PPR（第二个EPSC的振幅除以第一个EPSC）显著增加(*第页=0.0165，Kolmogorov-Smirnov检验；n个=30）。（F–H）所有测试细胞的结果(n个=21），第一次显著下降(****第页<0.0001）和秒(****第页<0.0001）EPSC（Wilcoxon配对符号秩检验）。（H）所有细胞的PPR显著增加(***第页=0.0017，成对t吨-测试；n个= 21). 在（F–H）条形图显示平均值，线条对应单个值对。
图4
图4
小型EPSCs（mEPSCs）被外-NL1抑制。（A）CA3区锥体神经元中记录的mEPSC示例。五个叠加录音。（B）在记录的神经元顶端树突附近，在同一个神经元上喷出一小口外源性NL1后进行记录（五条重叠的痕迹）。注意mEPSC的频率显著下降。（C）控制条件下和外-NL1吞吐后mEPSCs的平均频率。显著降低（控制条件下mEPSC的平均频率：1.97±0.3 Hz；外-NL1后：1.14±0.3 Hz）；n个=7个单元；第页=0.015，Wilcoxon配对签名秩检验）。（D）振幅无变化（控制条件下mEPSCs的平均振幅：11.46±2.17 pA；外-NL1后：13.29±3.87 Hz；n个=7个单元；其中一对在图中不可见；第页=0.47，Wilcoxon配对签名秩检验。条形图显示平均值，线条对应单个值对。
图5
图5
RO 64-5229降低NL1的突触前抑制作用。（A）在控制条件下（灰色），在RO 64-5229（50μM）存在下，在CA3神经元中通过苔藓纤维刺激诱发EPSCs，并在顶部树突附近喷一口NL1（茶色）。（B–D）CA3神经元在控制条件下（铁）和在记录的神经元顶端树突（teal）附近吹气外-NL1后对两种刺激（S1和S2）的反应。（B）第一个EPSC的振幅略有下降（从−73.8±5.8降至−70.38±4.9 pA，第页=0.65，未配对t吨-测试；n个=30次扫描）。（C）第二个EPSC的振幅略有增加（从−121.5±7.8增加到−129.4±5.7 pA；第页=0.40，未配对t吨-测试；n个=30次扫描）。（D）PPR略有下降（从1.98±0.3降至1.93±0.1；第页=0.13，Kolmogorov-Smirnov检验；n个= 30).（E–F）所有测试细胞的结果(n个=9），第一次没有显著下降(第页=0.069）和秒(第页=0.087）EPSC（Wilcoxon配对签名秩检验）。（G）所有细胞的PPR显著增加（从1.5±0.16增加到1.7±0.22*第页=0.04，Wilcoxon配对签名秩检验；n个= 9). 在（E–G）条形图显示平均值，线条对应单个值对。
图6
图6
RO 64-5229减少了由外-NL1诱导的mEPSCs抑制。（A）CA3区锥体神经元中RO 64-5229（50μM）存在时记录的mEPSC示例。五个叠加录音。（B）在记录的神经元顶端树突附近，在同一个神经元上喷出一小口外源性NL1后进行记录（五条重叠的痕迹）。（C）控制条件下和外-NL1吞吐后mEPSCs的平均频率。无显著降低（对照条件下mEPSC的平均频率：0.87±0.5 Hz；外-NL1后：0.77±0.41 Hz；n个=7个单元；第页=0.30，Wilcoxon配对签名秩检验）。（D）控制条件下和外-NL1吞吐后mEPSCs的平均振幅。无明显变化（控制条件下mEPSCs的平均振幅：10.15±1.44 pA；外-NL1后：9.49±1.30 Hz；n个=7个单元；第页=0.81，Wilcoxon配对签名秩检验）。条形图显示平均值，线条对应单个值对。
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