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.2017年5月30日;114(22):E4416-E4424。
doi:10.1073/pnas.1703171114。 Epub 2017年5月15日。

靶向炎症单核细胞APBA3/Mint3控制转移性生态位形成

附属公司

靶向炎症单核细胞APBA3/Mint3控制转移性生态位形成

原敏弘等。 美国国家科学院程序. .

摘要

癌症转移是由癌症细胞和正常细胞(如内皮细胞和巨噬细胞)共同策划的。单核细胞/巨噬细胞通常与癌细胞协同作用,促进肿瘤恶性化,即使在正常氧条件下,它们也会从糖酵解中获得一半以上的能量。这种糖酵解活性在常氧状态下由缺氧诱导因子1(HIF-1)及其激活物APBA3的功能维持。APBA3抑制部分抑制巨噬细胞功能并影响癌转移的机制值得关注,以避免治疗过程中完全抑制巨噬细胞功能的不利影响。在这里,我们报告了APBA3缺乏小鼠的转移减少,对原发性肿瘤生长没有明显影响。炎性单核细胞中APBA3缺乏强烈表达趋化因子受体CCR2,并从转移部位向趋化因子CCL2募集,阻碍细胞向转移部位的糖酵解依赖性趋化性,并抑制VEGFA表达,与HIF-1缺乏症的作用类似。宿主APBA3诱导靶器官内皮细胞中VEGFA介导的E-selectin表达,从而促进癌细胞外渗和微转移形成。给予E-选择素中和抗体也可以消除宿主APBA3介导的转移形成。因此,靶向APBA3可用于控制炎症单核细胞的转移性小生境形成。

关键词:APBA3/Mint3;巨噬细胞;转移。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
宿主APBA3缺乏影响转移。(A类)静脉注射B16F10细胞在WT中接种14天后的肺转移负荷(n个=11)或阿帕3−/−小鼠(n个=10)。(B类)WT的存续或阿帕3−/−小鼠静脉注射B16F10细胞后。n个=每组7人。(C类)静脉注射LLC细胞在WT或阿帕3−/−老鼠。n个=每组10人。(D类)WT的存续或阿帕3−/−小鼠静脉注射LLC细胞后。n个=每组9个。(E类)静脉注射4T1细胞在WT中接种后14天的肺转移负荷(n个=11)或阿帕3−/−小鼠(n个= 9). (F类)WT的存续或阿帕3−/−小鼠静脉注射4T1细胞后。n个=每组6人。数据表示平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试。
图2。
图2。
宿主APBA3缺乏减少转移定植和外渗。(A类B类)WT和WT肺B16F10细胞转移生长的宏观分析阿帕3−/−老鼠。(A类)WT和阿帕3−/−老鼠。(B类)通过测量病灶直径对转移生长进行量化和分类。n个=每组3个(18至74个病灶)。(C类D类)B16F10细胞在WT或阿帕3−/−小鼠静脉接种后1或24小时。(C类)肺部B16F10细胞集落(红色)的代表性照片。(比例尺,100μm)(D类)计算肿瘤病灶数。n个=每组7人*P(P)<0.05,由Mann–Whitney确定U型测试。(E类F类)WT或WT患者肺部B16F10细胞(绿色)和内皮细胞(CD31;红色)的共焦显微镜分析阿帕3−/−老鼠。(E类)代表性照片。(比例尺,20μm)(F类)分析血管内和血管外B16F10细胞的比例。n个=45至68个单元格。P(P)<0.05,根据Fisher精确测试确定。数据表示为平均值±SEM。
图S1。
图S1。
宿主APBA3缺乏减少LLC和4T1细胞的转移定植和外渗。(A类)具有B16F10细胞集落的肺切片代表性照片(红色)。B16F10细胞在WT或阿帕3−/−小鼠静脉接种后1或24小时。(比例尺,100μm)(B类)WT或WT患者肺部B16F10细胞(绿色)和CD31-阳性内皮细胞(红色)的代表性3D图像阿帕3−/−小鼠静脉接种后1或24小时。(比例尺,20μm)(C类)LLC细胞在WT或阿帕3−/−小鼠静脉接种后1或24小时。计算肿瘤病灶数。n个=每组6或7人*P(P)<0.05,由Mann–Whitney确定U型测试。(D类)基于共焦显微镜的WT或阿帕3−/−老鼠。分析血管内和血管外LLC细胞的比例。n个=52或53个单元格。P(P)<0.05,根据Fisher精确测试确定。(E类)4T1细胞在WT或阿帕3−/−小鼠静脉接种后1或24小时。计算肿瘤病灶数。n个=每组6或7人**P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试。(F类)基于共焦显微镜的WT或阿帕3−/−老鼠。分析血管内和血管外4T1细胞的比例。n个=52至65个单元格。P(P)<0.05,根据Fisher精确测试确定。
图3。
图3。
宿主APBA3缺乏降低肿瘤诱导的内皮细胞E-选择素表达。(A类B类)静脉注射B16F10细胞(绿色)后6 h肺部E-选择素免疫染色。(A类)WT小鼠肺部E-选择素(红色)和B16F10细胞(绿色)的代表性照片。(比例尺,20μm)(B类)对肿瘤诱导的E-选择素阳性细胞进行计数。n个= 6. (C类)静脉注射B16F10细胞后6h,对WT小鼠肺部E-选择素(红色)和CD31(绿色)进行免疫染色。(比例尺,10μm)(D类E类)静脉注射E-选择素中和抗体或大鼠IgG,然后在WT或阿帕3−/−老鼠。(D类)转移肺的代表性照片。(E类)计算肺部转移灶的数量。n个=每组5或6人。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试。NS,不显著。
图S2。
图S2。
宿主APBA3缺乏降低肿瘤诱导的肺部E-selectin mRNA表达。E-选择素的实时定量PCR分析(A类),P-选择素(B类),VCAM(C类)和ICAM(D类)WT或阿帕3−/−小鼠在静脉注射B16F10细胞后的指定时间(n个= 3). 数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05.
图4。
图4。
骨髓细胞中VEGFA的抑制和APBA3的缺乏阻碍了E-选择素的诱导。(A类)静脉注射VEGFA中和抗体或山羊IgG,然后接种B16F10细胞后6 h,对WT小鼠肺部E-选择素进行免疫染色分析。对肿瘤诱导的E-选择素阳性细胞进行计数。n个=每组5人。(B类C类)静脉注射B16F10细胞6小时后WT小鼠肺中VEGFA和细胞标志物的免疫染色分析。(B类)肺部VEGFA(绿色)和细胞标记物(红色)的代表性照片。(比例尺,10μm)(C类)分析细胞标记阳性细胞和VEGFA阳性细胞的比例。n个=每组3个(21至130个细胞)。(D类)静脉注射荧光素标记的B16F10细胞(蓝色)6 h后,免疫染色分析WT小鼠肺部CD68(红色)和E-选择素(绿色)的表达。(比例尺,10μm)(E类)LysM-cre(对照)或LysM-cre肺部E-选择素阳性细胞的定量分析;阿帕3飞行/飞行小鼠静脉注射B16F10细胞6小时后。n个= 5. (F类)LysM-cre(对照)或LysM-cre中的肺转移负荷;阿帕3飞行/飞行小鼠静脉注射B16F10细胞后14天。n个=每组11人。数据表示平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试。
图S3。
图S3。
B16F10细胞中VEGFA的缺失并不影响肿瘤诱导的转移性肺中E-selectin的表达。(A类)对照(shLacZ处理)和VEGFA缺失(shVEGFA处理)B16F10细胞中的VEGFA mRNA水平。n个=每组3人。所示数据代表平均值±标准偏差(B类)静脉注射对照细胞和VEGFA缺失的B16F10细胞6小时后,对小鼠肺部E-选择素阳性细胞进行定量分析。n个=每组5人。所示数据代表平均值±SEM。
图S4。
图S4。
单核细胞/巨噬细胞耗竭抑制转移。WT或阿帕3−/−小鼠静脉注射脂质体-氯膦酸盐或对照脂质体(L-PBS)14天后,接种B16F10细胞。(A类)转移肺的代表性照片。(B类)计算肺部转移灶的数量。n个=每组6人。数据表示为平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01。NS,不显著。
图5。
图5。
APBA3缺乏可减弱炎性单核细胞对转移部位的趋化性。(A类)WT患者骨髓和脾脏IMs的流式细胞术分析阿帕3−/−老鼠。n个=每组6人。(B类C类)外周血IMs的流式细胞术分析(B类)和肺部(C类)WT或阿帕3−/−小鼠静脉注射B16F10细胞或PBS后4小时。n个=每组4或5人。(D类E类)常驻单核细胞的流式细胞术分析(D类)和中性粒细胞(E类)静脉注射B16F10细胞或PBS于WT或阿帕3−/−老鼠。n个=每组4或5人。(F类)静脉注射WT或LysM-cre中的B16F10细胞后4h肺IMs的流式细胞术分析;阿帕3飞行/飞行老鼠。n个=每组5人。数据表示平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试。
图S5。
图S5。
骨髓细胞定义的流式细胞术策略。炎症性单核细胞、常驻单核细胞和中性粒细胞的特征是细胞表面标记物CD45、CD11b、CD115、Gr-1、Ly-6C、Ly-6G和CCR2。
图S6。
图S6。
APBA3缺乏不影响CCL2和CCR2的表达。(A类B类)肺中CCL2的定量分析(A类)或外周血(B类)WT或阿帕3−/−小鼠静脉注射B16F10细胞或PBS后4小时。n个=每组4人。误差条表示SEM(C类)流式细胞术分析WT或阿帕3−/−老鼠。APC,别藻蓝蛋白。
图6。
图6。
IMs中APBA3缺乏可减弱糖酵解依赖性趋化性、VEGF表达和转移。(A类)腹腔注射重组CCL2后6h腹腔IMs的流式细胞术分析;阿帕3飞行/飞行老鼠。n个=每组5人。(B类)在WT小鼠腹腔注射重组CCL2后6小时,在给予糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖后,对腹膜IMs进行流式细胞术分析。n个=每组4或5人。(C类)静脉注射B16F10细胞后4小时肺IMs的流式细胞术分析阿帕3−/−给予或不给予2-DG的小鼠。n个=每组5人。(D类)定量分析载体或2-DG给药WT或阿帕3−/−小鼠静脉注射B16F10细胞6小时后。n个=每组6人。(E类)定量分析载体或2-DG给药WT或阿帕3−/−小鼠在静脉注射B16F10细胞6小时后。n个=每组6人。(F类)转移灶的数量和在载体或2-DG给药的WT或阿帕3−/−小鼠静脉注射B16F10细胞后14天。n个=每组6人。(G公司)WT中的ATP水平,阿帕3−/−和LysM-cre;Hif1a型飞行/飞行带或不带2-DG的IM。n个=每组3人。(H(H))WT中糖酵解相关基因的mRNA水平,阿帕3−/−和LysM-cre;Hif1a型飞行/飞行即时消息。n个=每组3人。()素食主义者WT中的mRNA水平,阿帕3−/−和LysM-cre;Hif1a型飞行/飞行即时消息。n个=每组3人。(J型)WT或阿普巴3−/−小鼠尾静脉注射B16F10细胞(含或不含WT IMs)后14天。n个=每组9人。(A类F类J型)误差条表示SEM(G公司)错误栏指示SD*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试(A类F类J型)或学生的测试(G公司).
图S7。
图S7。
体外对B16F10细胞进行2-DG治疗不会影响随后的转移形成。接种前,B16F10细胞经载体或2-DG体外处理1小时后的肺转移负荷。(A类)转移肺的代表性照片。(B类)对肺部转移灶的数量进行计数。n个=每组6人。所示数据代表平均值±SEM。
图7。
图7。
宿主APBA3控制自发性肺转移中的转移微环境。(A类)WT中Lewis肺癌细胞的皮下肿瘤生长(n个=6)或阿帕3−/−小鼠(n个= 7). (B类)WT或WT脂肪垫中4T1细胞的肿瘤生长阿帕3−/−老鼠。n个=每组6人。(C类)WT接种后21天LLC细胞的自发性肺转移负荷(n个=14)或阿帕3−/−小鼠(n个= 12). (D类)WT或WT接种后28天4T1细胞的自发性肺转移负荷阿普巴3−/−老鼠。n个=每组6人。(E类)皮下注射WT或阿帕3−/−老鼠。n个=每组5人。(F类)脂肪垫注射WT或WT中4T1细胞后第7天肺IMs的流式细胞术分析阿帕3−/−老鼠。n个=每组5人。(G公司)LLC荷瘤WT或阿帕3−/−小鼠接种肿瘤后14d。n个=每组6人。(H(H))4T1荷瘤肺组织中VEGFA的免疫染色分析阿帕3−/−小鼠接种肿瘤后7d。n个=每组5人。()携带WT或WT的LLC肿瘤患者肺中E-选择素的免疫染色分析阿帕3−/−小鼠接种肿瘤后14d。n个=每组5人。(J型)4T1肿瘤患者肺组织E-选择素免疫组化分析阿帕3−/−小鼠接种肿瘤后7d。n个=每组5人。数据表示平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,由Mann–Whitney确定U型测试。
图8。
图8。
APBA3介导转移的示意图。转移部位的癌细胞和/或基质细胞分泌趋化因子(例如CCL2)。包括炎性单核细胞在内的炎症细胞向趋化因子迁移。IMs中的APBA3促进糖酵解依赖性的趋化作用到转移部位。APBA3还促进IMs中VEGFA的转录。转移部位的IM分泌VEGFA,诱导内皮细胞E-选择素表达和血管通透性。癌细胞利用内皮细胞中的E-选择素,促进有效的外渗和转移。
图S8。
图S8。
宿主APBA3缺乏降低了转移性肺的血管通透性。(A类)WT或阿帕3−/−小鼠在静脉注射B16F10细胞后的指定时间。小鼠在被杀前30分钟静脉注射荧光素标记的右旋糖酐(红色)。(B类)WT或WT患者肺部右旋糖酐通透性的定量分析阿帕3−/−小鼠在静脉注射B16F10细胞后的指定时间。n个=每组6人。(C类)静脉注射VEGFA中和抗体或山羊IgG,然后接种B16F10细胞,6小时后分析WT小鼠肺部右旋糖酐的通透性。n个=每组6人。所示数据代表平均值±SEM**P(P)<0.01。(D类)静脉注射E-选择素中和抗体或大鼠IgG,然后接种B16F10细胞6小时后,分析WT小鼠肺部的右旋糖酐渗透性。n个=每组6人。所示数据代表平均值±SEM。

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