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.2017年6月2日；28(22):224001.
doi:10.1088/1361-6528/aa6d15。 Epub 2017年5月10日。

微流体混合三嵌段胶束复合物对体内外基因沉默和细胞内转运的影响

丹尼尔·费尔德曼 1, 谢玉然, 史蒂文·琼斯, 东岳余, 安娜·莫兹钦斯卡, 奥利维亚·M·默克尔
附属公司

微流体混合三嵌段胶束复合物对体内外基因沉默和细胞内转运的影响

丹尼尔·费尔德曼等。 纳米技术. .

摘要

已证明三嵌段共聚物聚乙烯亚胺-聚己内酯-聚乙二醇（PEI-PCL-PEG）可以自发组装成纳米颗粒载体，能够与核酸络合用于基因传递。本研究的目的是研究微流控制备siRNA纳米颗粒后与常规使用的间歇反应器混合技术相比的胶束复合物特性及其在体外和体内的命运。其中，PEI-PCL-PEG纳米粒子是通过间歇反应器或微流体混合技术制备的，并通过各种生化分析和细胞内培养进行了表征。与分批反应器-移液管混合相比，微流体纳米颗粒显示出总体颗粒尺寸的减小以及更均匀的尺寸分布。共焦显微镜、流式细胞术和qRT-PCR显示了微流控制剂的亚细胞递送，并证实了实现mRNA敲除的能力。与间歇反应器配方相比，微流体配方的气管内滴注导致GAPDH的敲除效率显著提高（p<0.05）。微流体混合技术的使用产生了一种整体更小、更均匀的PEG-PCL-PEI纳米颗粒，能够更有效地在体内传递siRNA。当需要扩大生产定义明确的聚烯烃时，这种制备方法可能被证明是有用的。

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数字

图1
图1
微流体混合系统示意图。未显示用于以0.5 ml min的恒定速率混合聚合物和siRNA溶液的注射泵−1.
图2
图2
胶束复合物通过BR（间歇反应器）和MF（微流体混合）以N/P比6组装。两种配方均在N/P 6下进行测试，并在pH 7.4或4.5的条件下在肝素存在下培养30分钟。该肝素分析在pH 7.4下模拟了体内pH4.5时的循环模拟了晚期内体酸性环境。游离siRNA代表100%的siRNA释放。
图3
图3
采用流式细胞术测定中值荧光强度（MFI），以评估通过BR（间歇反应器）和MF（微流体混合）以6的N/P比和50 pmol Alexa Fluor-488标记的siRNA负载的胶束复合物在肺腺癌细胞（A549）中的细胞摄取。Lipofectamine 2000（LF）根据制造商的方案，使用50 pmol Alexa Fluor-488标记的siRNA制备聚合酶/脂肪酶。数据点表示平均值±SD(n个= 3). 单向方差分析。
图4
图4
在肺腺癌细胞（A549）中，GAPDH基因敲除效率在用通过分批反应器组装的胶束处理24小时后得到验证，并以N/P比6与50pmol hGAPDH siRNA的微流体混合β-肌动蛋白的表达并通过实时PCR进行定量。数据点表示平均值±SD(n个= 3). 单向方差分析，*P（P）< 0.01.
图5
图5
用不同的内吞抑制剂制霉菌素（10μ克毫升−1)，沃特曼（12 ng ml−1)、和甲基-β-环糊精（3 mg ml−1). 转染通过批式反应器（A）或微流体混合（B）组装的胶束复合体4小时后，通过流式细胞仪测量中值荧光强度，N/P比为6，50 pmol AF488 siRNA。数据点表明平均值±SD(n个= 3). 单因素方差分析***P（P）< 0.001.
图6
图6
TYE的细胞内给药™-在24小时转染胶束复合体后，通过共焦扫描激光显微镜评估563荧光标记的siRNA。对细胞样本进行免疫染色，以研究siRNA在以下亚细胞位置的共定位：（A）晚期内体（RAB7），（B）溶酶体（LAMP-1），（C）小窝（CAV-1）或（D）转高尔基体（WGA）。
图7
图7
体内从正常BALB/c小鼠分离的全肺RNA中验证了GAPDH基因敲除效率，这些小鼠通过间歇反应器和微流体混合以6的N/P比和750 pmol msGAPDH siRNA经气管内注入组装的胶束复合物β-肌动蛋白表达并通过实时PCR定量。数据点表示平均值±SD(n个= 4). 单向方差分析，*P（P）< 0.01,***P（P）< 0.001.
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