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.2017年5月5日；12（5）：e0177387。
doi:10.1371/journal.pone.0177387。 2017年电子收集。

子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中PI3K/Akt通路的调控

弗朗索瓦·法比 1, 凯西·格雷尼尔 1, 苏菲父母 1, 帕斯卡·亚当 1, 劳伦斯·塔迪夫 1, 瓦莱里·勒布朗 1, 埃里克·阿塞林 1
附属公司

子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中PI3K/Akt通路的调控

弗朗索瓦·法比等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

加拿大的不孕症不断增加，16%的加拿大夫妇在怀孕方面遇到困难。人们认为，不孕可能是由于胚胎和母体子宫内膜之间的沟通失调引起的。为了让植入窗口在适当的时候打开，子宫内膜基质细胞通过一种叫做蜕膜化的机制增殖和分化。子宫内膜蜕膜化过程中细胞凋亡和细胞增殖调控的细胞内和分子机制尚不完全清楚。此前已经充分证明，Akt在细胞存活和糖原合成中起着重要作用。Akt1、Akt2和Akt3亚型具有不同的生理作用；蜕膜化和妊娠期间也可能发生这种情况。本研究旨在探讨子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中PI3K/Akt通路的调控。测定蜕膜化过程中Akt亚型的表达、Akt活性（phospho-Akt）、pIκB和Akt底物。据我们所知，这些结果首次表明，在人类子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中，Akt亚型水平下降，Akt活性下调。我们还发现蜕膜化通过IκB（其抑制亚单位）的磷酸化诱导p65的核定位；然而，最近发现的细胞分化调节因子Par-4在蜕膜化时从细胞核中被取代。我们的结果还表明HIESC细胞在蜕膜化过程中表现出运动性下降，PI3K通路的抑制可能参与了这一过程。最后，我们证明了特定的Akt亚型对成功诱导蜕膜化具有独特的作用。进一步的分析将涉及调查，以了解该途径调控的确切信号机制。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。蜕膜化的诱导。
（A） 用cAMP（0.5 mM）和MPA（10-6M） 连续9天诱导HIESC从纺锤形变为卵圆形。使用奥林巴斯BX60显微镜以40倍放大率拍摄图像。（B） 用RT-PCR分析mRNA。β-actin作为内部对照。所示图像来自一个具有代表性的实验。图形表示密度计分析。（C） 在不同培养日（1、3、6和9），通过HIESC中的相同处理诱导PRL分泌。在第6天和第10天发现显著增加，第6天观察到最高水平（P<0.0001）。在三天的治疗后，对蜕膜标志基因的表达、PRL或IGFBP1的IGFBP1（D）mRNA表达进行量化。细胞在cAMP（0.5 mM）、MPA（10μM）或两者的组合存在下培养。三天后对细胞进行裂解，提取RNA并进行qRT-PCR分析以量化PRL或IGBP1的表达。18S mRNA表达作为qPCR结果的对照。所有数据均为均值±SEM三个独立实验。不同的字母代表不同的意思(第页<0.05).
图2
图2。蜕膜化诱导过程中Akt亚型、总Akt和pAkt的表达。
细胞在存在或不存在cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）的情况下孵育总共9天。然后提取总蛋白和RNA。（A） Western blot用于量化特定Akt亚型水平和总Akt水平的变化。pAkt（ser473）用于评估Akt活化，β-actin用作负荷对照。（B） 在对照培养基或cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）处理三天后对细胞进行计数，以评估蜕膜化对增殖的影响。使用台盼蓝排除染料评估样本中的死亡细胞数量。（C） 细胞在cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）处理下培养三天；然后进行计数；裂解等量的细胞并随后加载以进行蛋白质印迹分析。对总Akt、特定Akt亚型以及磷酸化Akt（ser473）的变化进行量化。（D） 细胞在cAMP（0.5 mM）、MPA（10μM）或两者的组合存在下培养。三天后对细胞进行裂解并提取总蛋白。Western blot检测总Akt、pAkt（ser473）、Par-4或FoxO1的变化；β-actin作为负荷对照。所示的所有斑点均来自一个具有代表性的实验。所有图形表示Western blot密度分析。所有数据均为均值±SEM三个独立实验。不同字母代表显著不同的平均值（p<0.05）；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图3
图3。通过诱导蜕膜化体外调节PI3K/Akt途径。
用cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）诱导蜕膜化48h，然后添加MG132并再孵育24h。（A） 在对照条件和蜕膜化细胞中，使用Mg132的处理增加了总泛素化，表明Mg132在抑制蛋白酶体降解方面是有效的。（B） Western blot检测总Akt和pAkt水平。（C） 通过Western blot评估个体Akt亚型水平。β-actin作为负荷对照。所示斑点来自一个具有代表性的实验。图形表示Western blot密度分析。（D） 对每个Akt亚型进行RT-PCR以评估mRNA转录的变化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。β-actin作为内部对照。所示图像来自一个具有代表性的实验。图形表示密度分析。所有数据均为均值±SEM三个独立实验。不同的字母代表着显著不同的平均值（p<0.05）。
图4
图4。PI3K/Akt途径的体外调节及其对蜕膜化的诱导作用。
在有或无cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）的情况下培养细胞共9天。在蜕膜化过程中测量mTOR和pmTOR蛋白表达（A）、Slug蛋白表达（B）和IκB/pIκB蛋白表达（C）。在蜕膜化的不同天数收集总蛋白。β-actin作为负荷对照。所示斑点来自一个具有代表性的实验。（D） cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）处理三天后收集细胞；然后对它们进行计数；对等量的细胞进行裂解，然后加载以进行Western blot分析。对总IκB和磷酸化IκB的变化进行量化。（E） 细胞在cAMP（0.5 mM）、MPA（10μM）或两者的组合存在下培养。三天后对细胞进行裂解并提取总蛋白。Western blot检测总IκB和p-IκB的变化；β-actin作为负荷对照。呈现的Western blots来自一个具有代表性的实验。所有图形表示Western blot密度分析。所有数据均为均值±SEM三个独立实验。不同字母代表显著不同的平均值（p<0.05）；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图5
图5。蜕膜化后蛋白质的亚细胞定位。
用cAMP（0.5mM）和MPA（10μM）诱导蜕膜三天（A）然后收获细胞，并按照制造商的方案进行细胞质/细胞核提取。采用Western blot鉴定Par-4、p65和FoxO1的变化。PARP用作核分数控制，GAPDH用作细胞质分数控制。所提出的印迹是一个具有代表性的实验。（B） 将HIESC接种在含有盖玻片的6个孔中，并在cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）存在下生长3天。然后用共焦显微镜观察p65和Par-4的定位。呈现的图像是一个具有代表性的实验。
图6
图6。PI3K/Akt通路的决定和抑制降低了细胞运动。
（A） 使用HIESC进行伤口愈合分析，HIESC使用载体或cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）处理。HIESC被允许增长，直到汇合；然后用尖端的钝端刮伤细胞单层，并在创伤后0、6、12和24小时拍摄图像，以评估细胞运动性。伤口闭合率被量化为恢复面积的百分比。（B）使用HIESC进行伤口愈合分析，HIESC使用载体或cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）处理。HIESC被允许增长，直到汇合；然后用尖端的钝端划伤细胞单层，并在伤后0、6、12和24小时拍摄图像，以评估细胞运动。治疗包括载体（对照）、cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）、10μM沃特曼（PI3K抑制剂）或100 nM雷帕霉素（mTOR途径抑制剂）或这些化合物的组合。伤口闭合率被量化为恢复面积的百分比。数据为均值±SEM三个独立实验。不同的字母表示显著不同的平均值（p<0.05）。使用奥林巴斯BX60显微镜以40倍放大率拍摄图像。
图7
图7。强制表达Akt亚型（CA-Akt）对PRL和IGFBP1表达的影响。
在三天的治疗后，对PRL（A）IGFBP1（B）的mRNA表达进行定量。用Akt1、Akt2或Akt3-Tet-On载体转染的HIESC细胞使用cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）进行蜕膜化。然后用多西环素（1μg/mL）联合治疗，以诱导组成性Akt亚型结构（cAMP+MPA+doxycycline）的表达，或者在添加多西环素前让细胞蜕膜24h（cAMP+MPA+Doxycybrine 24h）。三天后对细胞进行裂解，并进行qRT-PCR分析以量化PRL或IGBP1的表达。β-actin mRNA表达作为qPCR结果的对照。（C） Akt 1、Akt2和Akt3表达在治疗三天后进行量化。用Akt1、Akt2或Akt3-Tet-On载体转染的HIESC细胞使用cAMP（0.5 mM）和MPA（10μM）进行蜕膜化。然后用多西环素（1μg/mL）联合治疗，以诱导组成性Akt亚型结构（cAMP+MPA+多西环碱）的表达。三天后对细胞进行裂解，并进行qRT-PCR分析以量化Akt1、Akt2或Akt3的表达。β-actin mRNA表达作为qPCR结果的对照。数据为均值±SEM三个独立实验。不同的字母代表着显著不同的平均值（p<0.05）。
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