In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis

doi:10.1038/nbt.3836

.2017年6月；35(6):569-576.

doi:10.1038/nbt.3836。 Epub 2017年5月1日。

大肠癌和转移的体内基因组编辑和器官移植模型

贾汀·罗珀^1 2 三, Tuomas Tammela公司¹, Naniye Malli Cetinbas公司¹, 亚当·阿卡德¹, 阿里·罗哈尼安^1 4, 斯特芬·里克尔特¹, 穆罕默德·阿尔梅克达迪¹, 凯瑟琳·吴¹, 马提亚斯·奥伯里¹, 弗朗西斯科·桑切斯·里维拉¹, Yoona K公园¹, 徐亮¹, 乔治·英^1 5, 马丁·泰勒⁵, 罗克珊娜·阿兹米¹, 德米特里·凯德林¹, Rachit Neupane公司¹, 塞米尔·贝亚兹¹, 伊瓦·T·西钦斯卡⁶, 伊维利斯·苏亚雷斯⁷, 詹姆斯·尤奥^三 8, 师陈莉⁸, 劳伦斯·祖克伯格⁵, 佩卡·卡塔基斯托^9 10, 维克拉姆·德斯潘德⁵, 亚当·巴斯斯⁶, 菲利普·N·齐奇利斯^三, 杰奎琳·李斯¹, 罗伯特·兰格¹, 理查德·奥海恩斯^1 11, 陈建柱¹, 阿尔琼·布特卡尔（Arjun Bhutkar）¹, 泰勒·杰克^1 11, 厄默·H·伊尔马兹^1 5

附属机构

¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所。
²美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医疗中心胃肠科。
^三美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医学中心分子肿瘤研究所。
⁴英国南安普敦总医院南安普顿大学医学院癌症科学部。
⁵美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院病理科。
⁶美国马萨诸塞州波士顿达纳法伯癌症研究所肿瘤内科。
⁷美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医疗中心病理科。
⁸美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医疗中心外科。
⁹芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学生物技术研究所。
¹⁰瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所生物科学与营养系。
¹¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学院。

采购管理信息： 28459449
PMCID公司：项目编号：5462879
内政部： 10.1038/nbt.3836

大肠癌和转移的体内基因组编辑和器官移植模型

贾汀·罗珀等。天然生物技术. 2017年6月.

.2017年6月；35(6):569-576.

doi:10.1038/nbt.3836。 Epub 2017年5月1日。

作者

贾汀·罗珀^1 2 三, Tuomas Tammela公司¹, 纳尼耶·马利·塞廷巴斯¹, 亚当·阿卡德¹, 阿里·罗哈尼安^1 4, 斯特芬·里克尔特¹, 穆罕默德·阿尔梅克达迪¹, 凯瑟琳·吴¹, 马提亚斯·奥伯里¹, 弗朗西斯科·桑切斯·里维拉¹, Yoona K公园¹, 徐亮¹, 乔治·英^1 5, 马丁·泰勒⁵, 罗克珊娜·阿兹米¹, 德米特里·凯德林¹, Rachit Neupane公司¹, 塞米尔·贝亚兹¹, 伊瓦·T·西钦斯卡⁶, 伊维利斯·苏亚雷斯⁷, 詹姆斯·尤奥^三 8, 师陈莉⁸, 劳伦斯·祖克伯格⁵, 佩卡·卡塔基斯托^9 10, 维克拉姆·德斯潘德⁵, 亚当·巴斯斯⁶, 菲利普·N·齐奇利斯^三, 杰奎琳·李斯¹, 罗伯特·兰格¹, 理查德·奥海恩斯^1 11, 陈建柱¹, 阿尔琼·布特卡尔（Arjun Bhutkar）¹, 泰勒·杰克^1 11, 厄默·H·伊尔马兹^1 5

附属机构

¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所。
²美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医疗中心胃肠科。
^三美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医学中心分子肿瘤研究所。
⁴英国南安普敦总医院南安普顿大学医学院癌症科学部。
⁵美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院病理科。
⁶美国马萨诸塞州波士顿达纳法伯癌症研究所肿瘤内科。
⁷美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医疗中心病理科。
⁸美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨医疗中心外科。
⁹芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学生物技术研究所。
¹⁰瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡学院生物科学与营养系。
¹¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学院。

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PMCID公司：第5462879页
内政部： 10.1038/nbt.3836

勘误表in

更正：大肠癌和转移的体内基因组编辑和器官移植模型。
Roper J、Tammela T、Cetinbas NM、Akkad A、Roghanian A、Rickelt S、Almeqdadi M、Wu K、Oberli MA、Sánchez Rivera F、Park YK、Liang X、Eng G、Taylor MS、Azimi R、Kedrin D、Neupane R、Beyaz S、Sicinska ET、Suarez Y、Yoo J、Chen L、Zukerberg L、Katajisto P、Deshpande V、Bass AJ、Tsichlis PN、Lees J、Langer R、Hynes RO、Chen J、Bhutkar A、Jacks T，伊尔马兹·H。 Roper J等人。国家生物技术。2017年12月8日；35(12):1211. doi:10.1038/nbt1217-1211a。国家生物技术。2017 采购管理信息：29220013

摘要

体内对肿瘤发生相关基因功能的询问受到了生成和跨种系突变小鼠的需要的限制。在这里，我们描述了建立结直肠癌（CRC）和转移模型的方法，这些方法依赖于原位基因编辑和无癌递呈突变的小鼠原位器官移植。以CRISPR-Cas9为基础编辑结肠上皮细胞中的Apc和Trp53抑癌基因，以及原位移植经Apc编辑的结肠类器官，均可诱导自体肿瘤形成。ApcΔ/Δ；喀斯特^G12D系列/+;Trp53Δ/Δ（AKP）小鼠结肠类器官和人CRC类器官植入远端结肠并转移至肝脏。最后，我们应用原位移植模型来表征Lgr5的克隆动力学⁺干细胞和证实已建立的结肠腺瘤中癌基因的顺序激活。这些实验系统能够在体内快速表征癌症相关基因，并再现肿瘤进展和转移的整个光谱。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性财务利益表：作者没有相互竞争的经济利益

数字

**图1。基于CRISPR-Cas9原位Apc结肠上皮编辑诱导腺瘤形成**
(一)野生型小鼠粘膜注射1000个转化单位（TU）/μl U6:：sgApc-EFS:：Cas9-P2A-GFP慢病毒后的肿瘤。白光结肠镜检查、亮场尸检、GFP荧光尸检、苏木精-伊红（H&E）染色和β-连环蛋白免疫组化显示肿瘤。注意肿瘤中GFP的片状表达（箭头所示）。(b)肿瘤*罗莎26^{LSL-Cas9-eGFP类/+}*小鼠粘膜输送编码sgRNA的慢病毒后*亚太区*和Cre重组酶（U6:：sgApc CMV:：Cre，10000 TU/μl）（白光结肠镜检查、明视野尸检和GFP荧光尸检；H&E免疫组织化学和GFP/β-catenin免疫荧光）。GFP肿瘤荧光显示Cre诱导的Cas9和eGFP的表达*罗莎26*轨迹。(**c（c）**)肿瘤发生*罗莎26^{LSL-Cas9-eGFP蛋白/+};维尔林^CreER公司*用三苯氧胺处理的小鼠，然后将编码sgApc和turbRFP的慢病毒（U6:：sgApc EFS:：turbRFP，10000 TU/μl）注射到结肠粘膜中（白光/GFP/turbRFP荧光结肠镜检查和明场/GFP/turbRFP荧光尸检；GFP/turbRFP免疫荧光）。箭头表示基质细胞中的turboRFP表达。箭头指向GFP/turboRFP双阳性肿瘤细胞。组织学图像为20倍，插图为60倍（比例尺：200μm）。虚线表示肿瘤。（tRFP:turboRFP；R26:Rosa26；N:正常；T:肿瘤）。

**图2。小鼠和患者源性结直肠癌原位移植模型**
**（a）**感染U6:：sgApc-EFS:：Cas9-P2A-GFP慢病毒的野生型结肠类器官原位移植后NSG小鼠远端结肠肿瘤。用白光/GFP荧光结肠镜、白光/GPP荧光尸检和GFP免疫荧光观察肿瘤。**（b）**NSG小鼠原位移植瘤*亚太区*Δ/Δ*，克拉斯^G12D系列/+，色氨酸*53Δ/Δ（AKP）结肠类有机物。肿瘤通过结肠镜检查、尸检、苏木精和伊红（H&E）染色、β-catenin免疫组织化学和CDX2免疫组织化学进行成像。**（c）**移植AKP结肠器质瘤的局部浸润和肝转移，如原发性结肠肿瘤的H&E和LYVE1免疫组织化学、尸检和肝转移的CDX2免疫组织化学所示。箭头表示侵犯固有肌层，箭头表示肿瘤侵犯LYVE1阳性淋巴管。(d日)患者衍生CRC器官原位移植后NSG小鼠的肿瘤。通过结肠镜检查、尸检、H&E染色、β-catenin免疫组化和CDX2/human Keratin20免疫组化证实肿瘤。**（e）**H&E染色、LYVE1免疫组织化学、肝脏尸检和CDX2/human Keratin20免疫组织化学显示患者源性器官样原位肿瘤的局部浸润和肝转移。箭头表示肌层侵犯，箭头表示LYVE1阳性血管肿瘤侵犯。组织学图像为20倍，插图为60倍（比例尺：200μm）。虚线表示肿瘤。（NSG：nod-SCIDγ；T：肿瘤；N：正常结肠；hKeratin20：人角蛋白20）。

**图3。原位结肠腺瘤Lgr5细胞系追踪和序列突变**
(一)结肠类有机物来源于*Lgr5级^{CreER公司/+};罗莎26^{LSL-td番茄/+}*小鼠接受基于CRISPR-Cas9的*亚太区*用U6:：sgApc EFS:：Cas9-P2A-GFP感染进行编辑，然后直接移植到NSG小鼠中以产生Apc-null体内肿瘤。荷瘤小鼠接受一剂量三苯氧胺，用tdTomato标记Lgr5+细胞及其子代，并在2天、3周或6周后进行评估。处死前4小时用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记增殖细胞。**（b）** 体内在细胞标记后2天、3周和6周通过白光、GFP荧光和tdTomato荧光结肠镜检查（虚线）进行肿瘤成像。**（c）**原位肿瘤的GFP、tdTomato和EdU免疫荧光图像。箭头表示标记后2天用tdTomato标记细胞（白色箭头）。箭头指向GFP阴性肿瘤区域，提示嵌合慢病毒沉默。免疫荧光图像分析：**（d）**td番茄+肿瘤面积相对于总GFP+肿瘤面积；**（e）**平均tdTomato+克隆大小（即总tdTomato+面积/克隆总数）；和**（f）**标记后6周，EdU+增殖tdTomato+、GFP+肿瘤细胞与EdU+增生tdTomato−、GFP=肿瘤细胞的比例。（每组和时间点N=3或4个肿瘤）。(g）给小鼠服用三苯氧胺2天后tdTomato+（箭头）的克隆激活*亚太区*-空*Lgr5级^{CreER公司/+};罗莎26^{LSL-td番茄/+};喀斯特^{LSL-G12D型/+}*肿瘤；**（h）**突变体处lox-stop-lox（LSL）盒的重组分析*喀斯特^{LSL-G12D型/+}*三苯氧胺介导的CreER激活反应位点。Tam x 3表示小鼠接受3次三苯氧胺脉冲的肿瘤，Tam x 1表示接受1次脉冲的肿瘤。最后一次三苯氧胺脉冲后48小时采集组织。野生型鼠尾DNA用作阴性对照*喀斯特^G12D系列/+;Trp53基因*Δ/Δ肺腺癌细胞系DNA（KP细胞）作为阳性对照*P<0.005（单向方差分析），**P=0.01（学生T检验）。（R26:Rosa26；NSG:nod SCID gamma；tdTom:tdTomato）

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中的注释

癌症模型：定制小鼠模型。
飞镖A。飞镖A。 Nat Rev癌症。2017年7月；17(7):395. doi:10.1038/nrc.2017.45。Epub 2017年6月9日。 Nat Rev癌症。2017 采购管理信息：28642600 没有可用的摘要。

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