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.2017年7月1日；313（1）：H32-H45。
doi:10.1152/ajpheart.00027.2017。 Epub 2017年4月28日。

容量超负荷心力衰竭患者左室收缩衰竭前结蛋白丢失和线粒体损伤

杰森·古查德（Jason L Guichard） 1 2, 迈克尔·罗戈夫斯基 1 三, 朱利奥·阿格内蒂 4 5, 连武赋 6, 帕梅拉·鲍威尔 7, 池昌伟 2 7, 詹姆斯·科恩 6, Louis J Dell意大利 8 2 7
附属公司

容量超负荷心力衰竭患者左室收缩衰竭前结蛋白丢失和线粒体损伤

杰森·古查德（Jason L Guichard）等。 美国生理学杂志心脏循环生理学. .

摘要

大鼠和人类因慢性容量过载（VO）导致的心力衰竭以心肌细胞结蛋白/线粒体网络的紊乱为特征。在这里，我们测试了结蛋白分解是整个VO的早期持续过程的假设。雄性Sprague-Dawley大鼠患有主动脉腔瘘（ACF）或假手术，并在24小时、4周和12周后进行检查。透射电镜（TEM）和免疫组织化学（IHC）检测结蛋白/线粒体超微结构。在分离的心肌细胞中进行蛋白质和激酶组分析，并用质谱法评估左心室组织中结蛋白的裂解。超声心动图显示，4周时左室质量体积比下降40%，出现球形重构，12周时出现ACF和左室收缩功能障碍。从24小时开始，持续到4周和12周，ACF的TEM证据表明线粒体广泛聚集，IHC证据表明与结蛋白分解相关的结构紊乱，以及经Western blot分析和质谱证实的结蛋白蛋白裂解。IHC结果显示，ACF心肌细胞在4周和12周时有来自Z盘的αB-晶体蛋白的核周移位，α，β-不饱和醛-4-羟基壬醇增加。蛋白标记物的使用以及TUNEL染色和基因体分析的验证表明，ACF第4周和第12周时未出现心肌细胞凋亡。p62/固碳体-1的六倍增加抵消了有丝分裂蛋白质指标的显著增加，这表明不能完成自噬。结蛋白/线粒体结构的早期持续破坏，伴随着氧化应激、凋亡和有丝分裂抑制，表明其在左室扩张和VO收缩功能障碍中起着因果作用。新的&值得注意的这项研究提供了新的证据，证明在容量超负荷心力衰竭的整个过程中，结蛋白早发（24小时）和持续（4-12周）的排列不当以及正常肌节和线粒体结构的破坏，表明结蛋白切割与线粒体紊乱和损伤之间存在因果关系。

关键词：细胞凋亡；心肌细胞；结蛋白；心力衰竭；线粒体。

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数字

图1。
图1。
主动脉腔静脉瘘（ACF）大鼠24小时、4周和12周左心室（LV）结蛋白（绿色）和电压依赖性阴离子通道（红色）免疫组化及年龄匹配的假手术对照动物。假手术动物在每个时间点的图像显示，Z盘和夹层盘的结蛋白染色正常，线粒体的VDAC染色呈线性分布。ACF动物的LV中，一些心肌细胞的结蛋白和VDAC染色弥漫性丢失，大面积的VDAC着色强烈，与透射电子显微镜（TEM）图像中的线粒体聚集一致。
图2。
图2。
24小时、4周和12周时，ACF组织×4500的TEM图像。TEM图像显示ACF心肌细胞中存在大量线粒体聚集。在操作不当的对照动物中观察到线粒体高度有序的线性注册被破坏，ACF中横跨肌节a带的线粒体更长。M、 线粒体；N、 细胞核；→, 线粒体断裂区域。
图3。
图3。
12周时ACF的TEM图像。一只假手术大鼠12周LV的TEM图像(顶部)和2只12周时患有ACF的大鼠(中间的和底部)如图所示。左侧：放大倍数×4000；正确的：放大倍数×12000。白色方框表示放大倍数较高的区域。心肌细胞线粒体肿胀，嵴溶解。M、 线粒体；N、 细胞核。
图4。
图4。
24小时、4周和12周患ACF大鼠左室结蛋白的Western blot检测，以及年龄匹配的假手术大鼠。通过Western blot分析，在24小时和4周时，ACF样品中的结蛋白降解增加，而在12周时样品中没有影响。量化(n个=每组7只），显示结蛋白裂解产物增加（与年龄匹配的假手术动物相比，ACF组24小时和4周时的49-kDa蛋白增加）。与年龄匹配的假手术动物相比，ACF在24小时和4周时也增加了完整结蛋白总量。
图5。
图5。
结蛋白及其片段的质谱（MS）序列覆盖率。MS也证实了完整结蛋白（53 kDa）和～49和～25 kDa片段（分别为F1和F2）对应带中的结蛋白序列覆盖率。
图6。
图6。
ACF大鼠4周和12周时LVs和年龄匹配的假手术大鼠LVs中αB-结晶蛋白（红色）的免疫组织化学。在正常的假手术动物中，αB-晶体蛋白（红色）与Z盘共定位。在伴有ACF的LVs中，有广泛的结蛋白丢失，并且αβ-晶体蛋白的聚集区域在核周区域最为突出。
图7。
图7。
ACF LVs和假手术动物LVs中VDAC（绿色）和4-羟基-2-壬醛（HNE；红色）的免疫组织化学。假手术LV具有VDAC的条纹状线性模式（绿色），很少有HNE染色（红色）。蓝色显示DAPI染色的细胞核。患有ACF的心脏中，VDAC广泛丢失，核周染色增加，HNE染色增加，这与TEM图像中的线粒体聚集和肉质降解相一致。
图8。
图8。
4周和12周ACF动物LV心肌细胞自噬和抗凋亡蛋白标记物上调。在4周和12周时从患有ACF的动物和假手术大鼠中分离出心肌细胞。用SDS-PAGE分析等量的细胞裂解物，并转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后进行免疫印迹分析。A类：针对轻链（LC）3、p62、beclin和GAPDH的特异性抗体。条形图位于正确的在4周和12周时，患有ACF的动物的心肌细胞在LC3II/GAPD、p62和beclin-1方面与未手术的动物相比增加了倍(n个=每组4人*P（P）< 0.05).B类：4周和12周时年龄匹配的假手术大鼠和ACF大鼠线粒体损伤和有丝分裂标志物的典型Western blots图像。条形图位于正确的与假手术动物相比，ACF动物4周和12周时心肌细胞中磷酸化（p-）动力相关蛋白1（DRP1）、DRP1、PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）、parkin、热休克蛋白（Hsp）60和亲环素D（CypD）（正常化为GAPDH后）显著增加一倍(n个=每组4人*P（P）< 0.05).
图9。
图9。
ACF大鼠心肌细胞抗凋亡蛋白标记物上调。A类：心肌细胞裂解物的制备如图7所示。在4周和12周患ACF的大鼠以及年龄匹配的假手术对照大鼠中显示出典型的Western blot。B类：条形图，显示Bad、p-Bad/Bad、Bcl-x中的显著倍数增加我与假手术动物的水平相比，ACF 4周时的Akt、Akt和p-Akt/Akt。C类：条形图显示Bad、p-Bad/Bad、Bcl-x的显著增加我与假手术动物相比，12周ACF动物心肌细胞中的Akt和p-Akt/Akt（归一化为GAPDH）。n个=每组4人*P（P）< 0.05.
图10。
图10。
TUNEL染色显示ACF中没有心肌细胞凋亡。使用末端荧光法TUNEL试剂盒对石蜡包埋切片进行TUNEL分析。与年龄匹配的假手术动物相比，患有ACF的动物在4周和12周时很少或没有LV心肌细胞显示阳性TUNEL染色。DNA酶I处理石蜡包埋组织切片，导致染色体DNA断裂，作为阳性对照（绿色）。的代表性图像n个=3个假手术组、4周ACF和12周ACF。红色，层粘连蛋白；蓝色，DAPI。
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