Migration pathways of sacral neural crest during development of lower urogenital tract innervation

doi:10.1016/j.ydbio.2017.04.011

.2017年9月1日；429(1):356-369.

doi:10.1016/j.ydbio.2017.04.011。 Epub 2017年4月25日。

骶神经嵴在下尿生殖道神经支配发育过程中的迁移途径

凯莉·B·威斯¹, Karen K交易¹, Sara J爱尔兰¹, V阿什利·坎特雷尔¹, E米歇尔·索思密斯²

附属公司

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系遗传医学部，邮编37232-0275。
²美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系遗传医学部，邮编37232-0275。电子地址：michelle.southard-smith@vanderbilt.edu。

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骶神经嵴在下尿生殖道神经支配发育过程中的迁移途径

卡丽·B·维斯等。求文献一篇. 2017.

.2017年9月1日；429(1):356-369.

doi:10.1016/j.ydbio.2017.04.011。 Epub 2017年4月25日。

作者

凯莉·B·威斯¹, Karen K交易¹, Sara J爱尔兰¹, V阿什利·坎特雷尔¹, E米歇尔·索思密斯²

附属公司

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系遗传医学部，邮编37232-0275。
²美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系遗传医学部，邮编37232-0275。电子地址：michelle.southard-smith@vanderbilt.edu。

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摘要

颅骨和迷走神经嵴衍生祖细胞（NCPC）的迁移和命运已被广泛研究；然而，对骶骨NCPC的了解要少得多，尤其是在泌尿生殖系统中的分布。为了构建NCPC迁移到发育中的下尿路的时空图，我们利用Sox10-H2BVenus转基因来可视化表达Sox10的NCPC。我们的目的是确定Sox10表达的NCPC与膀胱神经支配、平滑肌分化和胎儿发育至成年期间的血管形成的关系。圣体NCPC迁移是一个高度控制、特别定时的过程，有几个潜在的监管里程碑。神经分化伴随着骶骨NCPC的迁移而发生，甚至在骨盆神经节融合之前就存在神经元细胞体。交配后13.5天（dpc），骶骨NCPC位于盆腔神经节内，之后开始以渐进波的形式流入膀胱体。膀胱的平滑肌分化和血管化在神经支配之前开始，并且似乎是独立的过程。在成人膀胱中，大多数Sox10+细胞表达胶质标记物S100β，与其他组织中的胶质标记物Sox10一致。然而，在血管附近发现罕见的Sox10+NCPC，并非所有的都是S100β+，这表明胶质细胞异质性或Sox10+细胞在血管系统中的潜在非胶质作用。综上所述，此处提供的Sox10+NCPC迁移和成年膀胱中这些细胞分布的发育图谱将作为未来研究小鼠下尿路功能障碍模型的路线图。

关键词：自主神经系统；膀胱；下尿路；盆腔神经节；周围神经系统；骶神经嵴；索克斯10。

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数字

**图1。骶神经嵴源性祖细胞（NCPC）在和的分布*Sox10型*-H2B属胚胎**
显微剖切的泌尿生殖道的腹侧视图显示于(A类)14.5 dpcSox10型^{LacZ-KO公司/+}和(B)14.5 dpcSox10型-H2B属胚胎（70倍放大）。图示生殖器结节的上（前）表面。缩写：a，肾上腺；b、膀胱；cg，腹腔神经节；dn，背神经；e、附睾；gt，生殖器结节；hg，后肠；k、肾脏；t、睾丸；vd，输精管。

**图2。从整体上看骶骨NCPC向发育中的泌尿生殖道的初始迁移*Sox10型*-H2B属胚胎**
(A类)一个10 dpc胚胎的侧视图，用于H2BVenus荧光成像。尾巴的背表面用虚线勾勒出轮廓，最尾部的神经嵴细胞可见为点状斑点，这些斑点刚刚从后肢水平的神经管中出现，并用箭头标记。(B)表达H2BVenus的NCPC进入11 dpc胚胎腰骶水平生殖结节和盆腔间质的荧光图像（53倍放大）。(C类)*Sox10型*-微切下尿路侧视图中可见H2BVenus+祖细胞。在一个12 dpc的胚胎中，膀胱位于生殖器结节上方，脐血管后方看不见（放大50倍）。(D类)从12.5dpc胚胎中显微解剖的泌尿生殖系统的侧视图显示，Sox10+NCPC通过骨盆丛迁移，骨盆神经节原基（红圈）内的细胞明显聚集，骶骨NCPC迁移到生殖器结节。虚线表示生殖器结节的远端。（B）、（C）和（D）中的虚线表示膀胱两侧脐带血管的路径。缩写：e，eye；tg，三叉神经节；o、耳泡；背根神经节；gt，生殖器结节；pg，盆腔神经节；pp，骨盆丛。

**图3。骶部NCPC围绕后肾间质走行，在12 dpc时在骨盆神经节内形成松散聚集物**
(A类)通过11.25 dpc的中矢状位胎儿LUT的示意图显示了发育中的泌尿生殖窦的结构位置。后肾间质位于中线外侧（粉红色）。一条红线表示通过面板B所示的发育胚胎收集的截面平面的水平(B)通过11.25 dpc进行横向冷冻切片*Sox10型*-用DAPI染色的后肢水平的H2BVenus胚胎显示了后肾间质（虚线圈）的解剖结构以及泄殖腔与后肠的连接。(B′)用HuC/D（神经元胞体，蓝色）和TuJ1（神经元突起，红色）抗体对A组切片进行免疫染色，显示迁移的相对位置*Sox10型*-H2B菜单+NCPC（绿色）（100倍放大）。(B〃)A〃中方框区域的高倍图像（200×）显示用箭头强调的HuC/D+细胞。(C类)12 dpc时中矢状体胎儿LUT的示意图显示了形成原始膀胱的位置以及后肾间质（粉红色）相对于后肠的上升。红线表示面板D中所示的截面平面(D类). 12 dpc骶骨区横向冷冻切片*Sox10型*-H2BVenus胚胎的轴向水平与图A所示相当。该阶段的DAPI染色显示神经管的神经束延伸以及后肠和泄殖腔的分隔。(D′)用抗HuC/D和TuJ1抗体对B组切片进行免疫染色，发现NCPC聚集物与分化神经元的HuC/D+细胞混合（放大100倍）。(D〃)面板B′中装箱区域的放大倍数（200×）。缩写：A，前；CL，泄殖腔；D、背侧；背根神经节；GT，生殖器结节；gtm，生殖器结节间质；hg，后肠；m、后肾间充质；n、神经束；nt神经管；P、后部；PBL，原始膀胱；pc，腹腔；泌尿生殖道膜；UGS，泌尿生殖窦；upe，尿道板上皮；输尿管；尿直肠隔，V，腹侧。比例尺=100微米。面板A和C中的示意图是根据Georgas等人，2015年修改的。

**图4。骶骨NCPC通过从骨盆神经节迁移到膀胱体来填充原始膀胱**
胎儿膀胱组织微密度从12.5 dpc降至15.5 dpcSox10型-将H2BVenus胚胎放平，并通过荧光立体显微镜从正面成像（4×-10×放大）。NCPC用明亮的荧光标记*Sox10型*-由于H2BVenus报告者的核定位，H2BVrenus转基因位于盆腔神经节无核区，可见为单个离散细胞，向膀胱体迁移14.5 dpc。虚线描绘了泌尿生殖窦/膀胱两侧12.5和13.5 dpc的血管。14.5 dpc和15.5 dpc的膀胱明显存在膀胱穹隆。

**图5。Sox10+骶骨NCPC在整个发育中的生殖器结节中迁移的立体典型模式**
(A类)生殖器微小结节背（上）表面的整体图像*Sox10型*-顶行显示了从11.5到15.5 dpc每个发育时间点的H2BVenus胚胎，腹（下）面紧邻下方。11.5 dpc全幅图像面板中的箭头指示腹侧柱状聚集体的位置，该聚集体以11.5 dpc的速度发音，并消散13.5 dpc。虚线描绘了生殖器结节的远端。（放大100×-150×）(B)骶骨胚胎尾部横切面的荧光图像显示了*Sox10型*-H2BVenus+NCPC在后肾间质（m）周围向泌尿生殖窦（ugs）迁移，在更多的吻侧切片中（右）。11.5dpc时分散的Sox10+细胞群尚未到达形成泄殖腔的侧翼，在那里将形成盆腔神经节（中部）。在更多的尾部部分（左侧），当H2BVenus+细胞从中线的泌尿生殖上皮（uge）标记的体壁延伸时，可以在生殖结节内看到H2BVeuns+细胞流。单个截面为18微米，从最前端截面到最后端截面的整个跨度约为550微米。比例尺=200微米。

**图6。14.5 dpc时，骨盆神经节内的神经-胶质谱系分化正在进行**
冷冻切片显示胎儿盆腔神经节相对于膀胱的相对大小和位置(顶部，100倍放大），其中Sox10+NCPC通过强烈的H2BVenus表达来标记。用BFAPF抗体（红色，早期胶质标记物，左柱板）免疫染色的冰冻切片的共焦图像如下所示*Sox10型*-H2B菜单+细胞（绿色，A）在合并图像中显示出共同定位（箭头，A〃）。有些Sox10+核不显示任何BFABP共定位（箭头，A〃）。低于14.5 dpcSox10型-在对该抗原进行染色的冰冻切片中（箭头，B′），H2BVenus+与周围胶质细胞的更成熟标记S100b（红色，中间柱面板，B–B〃）共同定位，而大多数H2BVeuns+细胞没有S100b标记（箭头，B〃）。相反，盆腔神经节PGP9.5染色的共焦图像（红色，神经元标记物，右柱面板C–C〃）显示，由于残余的持久性，与该标记物的共同定位有限*Sox10型*-H2BVenus+转基因细胞已向神经元谱系发展（箭头，C′），而*Sox10型*-与PGP9.5（箭头，C〃）无共同定位的H2B基因组+细胞。所有图像的共焦放大倍数为400倍。面板A〃、B〃和C〃的右上角显示了用于说明共同定位的高倍插图。缩写：b，膀胱；pg，盆腔神经节，um，尿路上皮；乌拉，乌拉丘斯。面板A–C〃中的比例尺=50微米。

**图7。骶骨NCPC迁移的时间和空间独立性*Sox10型*-H2B基因表达与膀胱壁平滑肌和血管系统发育的关系**
12.5 dpc至15.5 dpc发育中下泌尿生殖道的矢状冷冻切片图像*Sox10型*-图中显示了H2B基因组+胚胎。作为H2BVenus转基因荧光（绿色）的结果，表达Sox10的NCPC在对钙蛋白酶（红色，图a、C、E、G）进行免疫染色以单独检测平滑肌的切片中可见，或在图B、D、F、H中对PECAM（蓝色，内皮细胞）和TuJ1（红色，神经元过程）进行联合免疫染色。在所有图像中，胚胎的腹侧位于右侧。PECAM和TuJ1的冰冻切片免疫染色位于用于检测calponin的中矢状切面外侧约160μm处。因此，在用于PECAM/TuJ1检测的部分中，一些中线结构不可见。所有荧光（calponin）和共焦（PECAM/TuJ1）图像均以100倍放大率拍摄，并在Adobe Photoshop中平铺，以生成所示的合成图像。星号表示将后肠与泄殖腔分开的延伸的尿直肠隔的位置（虚线轮廓，图A、B），此处最初出现以钙蛋白免疫反应为标志的平滑肌分化。虚线圆圈强调了15.5 dpc时膀胱颈和尿道交界处calponin染色连续性的缺口。箭头表示单个Sox10+NCPC的位置，它们是尿道和膀胱壁的组成部分。最右边一栏中的高倍插图与面板D、F和H中的盒装插图一致。13.5 dpc时缩写为：b，膀胱；cl，泄殖腔（虚线轮廓）；gt，生殖器结节；hg，后肠；ps，发育耻骨联合；u、尿道；输尿管；乌拉，乌拉丘斯。比例尺=200微米。

**图8。17.5dpc发育期膀胱中NCPC与神经突起和血管的相关性**
顶部面板显示了E17.5膀胱的低倍（70倍）中矢状视图*Sox10型*-用神经元标记物PGP9.5（红色）和内皮标记物PECAM（蓝色）对H2BVenus（绿色）胎鼠进行免疫染色。A、B和C行中的图像是顶部面板中用虚线方块描绘的相应区域的放大倍数较高的视图（200倍）。典型*Sox10型*-A行和B行的箭头突出显示了与神经元突起密切相关的H2BVenus+胶质细胞。A行和B行的箭头强调了与血管内皮密切相关且远离神经元突起的罕见Sox10+细胞，C行所示的盆腔神经节内存在血管内皮细胞。这种细胞的紧密聚集排除了对Sox10+细胞亚群是否与内皮细胞比神经突起更密切相关的评估。许多实验室一致观察到尿路上皮用PGP9.5抗体染色（参见网址：www.gudmap.org基因表达数据库）。

**图9。成人膀胱中Sox10+NC衍生细胞与血管系统的关系**
(A类)成年小鼠冷冻切片的共焦图像*Sox10型*-放大100倍后，用PECAM（蓝色，血管内皮细胞）和PGP9.5（红色，神经细胞和尿路上皮）染色的H2BVenus转基因膀胱。单个表达Sox10的细胞通过H2BVenus报告基因的核表达进行标记（绿色）。(B)面板A中方框区域的高倍共聚焦图像显示膀胱壁上尿路上皮下方的单个荧光标记（放大200倍）。(C类)高倍率图像显示*Sox10型*-H2B属+细胞，其细胞核与PECAM+真空紧密相关，似乎包裹在血管周围（放大400倍）。缩写：det，逼尿肌；亚，粘膜下层；嗯，尿路上皮。比例尺=100微米。

**图10。成年小鼠膀胱Sox10+NC衍生细胞的异质性**
(A类)成人膀胱的低倍矢状图显示*Sox10型*-H2BVenus转基因（4倍放大）显示三个解剖层，尿道和膀胱穹隆标记以提供方向。尿路上皮和粘膜下层在空的成人膀胱中呈卷曲褶皱，当充满尿液时为扩张提供空间。虚线椭圆内显示壁内神经节。沿着膀胱的背侧有另外两个较小的壁内神经节。在用胶质标记物（S100β）和神经元标记物（PGP9.5）进行免疫组织化学染色后，高倍镜（200倍）下，右侧显示由盒装插图定义的膀胱壁区域。(B)在膀胱穹隆和膀胱背壁，Sox10+细胞主要为S100β+。然而，也存在罕见的Sox10+、S100β−细胞（箭头）和非常罕见的Sox10−、S100。(C类)在膀胱穹隆的逼尿肌中*Sox10型*-带有PGP9.5的H2B菜单。然而，在壁内神经节内，很少有*Sox10型*-也表达PGP9.5的H2B基因组+细胞（箭头）。神经节（箭头）附近存在一种罕见的Sox10+、PGP9.5+细胞。(D类)Sox10+细胞非常接近，但不与HuC/D+大的神经元核共定位，这些神经元核在壁内神经节（左侧）内以两到五个细胞组成的小组存在，或在膀胱壁（右侧）中以单个细胞的形式存在。缩写：serosa；det，逼尿肌；嗯，尿路上皮；ig，壁内神经节。比例尺面板B和C=100微米。比例尺面板D=20微米

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1. Atala A、Bauer SB、Soker S、Yoo JJ、Retik AB。组织工程自体膀胱，用于需要膀胱成形术的患者。柳叶刀。2006;367:1241–1246.-公共医学
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