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.2017年5月23日；116(11):1451-1461.
doi:10.1038/bjc.2017.110。 Epub 2017年4月27日。

Rassf1靶向microRNA miR-193a-3p过量干扰细胞分裂保真度

索菲亚·普鲁伊科宁 1 2 三, 马可·J·卡利奥 1 2
附属公司

Rassf1靶向microRNA miR-193a-3p过量干扰细胞分裂保真度

索菲亚·普鲁伊科宁等。 英国癌症杂志. .

摘要

背景：一些microRNA（miRNA）分子已成为肿瘤抑制因子和癌基因表达的重要转录后调节因子。Ras关联域家族成员1（RASSF1）是一种关键的肿瘤抑制因子，控制细胞增殖的多个方面，如细胞周期、细胞分裂和凋亡。RASSF1的表达因启动子甲基化过度而在多种癌症中丢失。

方法：通过双重筛选方法，miR-193a-3p被鉴定为RASSF1-靶向miRNA。在培养的人癌细胞中，采用免疫印迹、qRT-PCR、荧光素酶报告分析、延时显微镜和免疫荧光方法研究过量miR-193a-3p对RASSF1表达和细胞分裂的影响。

结果：在这里，我们报道了一种新的miRNA-介导的调节RASSF1表达的机制：miR-193a-3p直接与RASSF1-3'UTR结合并抑制mRNA和蛋白表达。在人类癌细胞中，miR-193a-3p过量通过破坏完成胞质分裂所需的Rassf1-Syntaxin 16信号通路导致多倍体。在下一个细胞周期中，miR-193a-3p过度表达的细胞表现出多极有丝分裂纺锤体、有丝分裂延迟和细胞死亡频率升高。

结论：我们的研究结果表明，除了表观遗传学调控外，特定miRNA的表达改变可能导致癌细胞中Rassf1的缺失，并导致细胞分裂错误。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
新型Rassf1调节miRNAs的鉴定。使用的两种筛选方法的流程图表示。(A类)目标预测屏幕。典型的显微照片显示由miRNAs过度表达引起的有丝分裂异常。比例尺为50 μ箭头指向检测到的有丝分裂缺陷的例子，如滞后染色体、染色质桥和多极有丝分裂纺锤体。最有效的miRNAs对Rassf1 mRNA和蛋白表达的抑制如下所示。(B)临床相关性筛查。该表显示了皮尔逊相关性和P（P）-最有效的miRNAs的值(n个=19）RASSF1系统乳腺肿瘤样本集中的mRNA表达。Rassf1 qRT-PCR和这些miRNAs的免疫印迹实验结果如下所示。目标预测屏幕(A类)产生了四个与临床相关的筛查(B)三个在图中用箭头标记的miRNA被击中。数据来自一个或两个实验（平均值±标准差）。
图2
图2
miR-193a-3p通过直接结合到RASSF1系统-3英尺UTR。(A类)用WT进行荧光素酶报告子分析的定量RASSF1系统-3′UTR和突变RASSF1系统-3′UTR，在预测的miR-193a-3p结合位点中包含一个4核苷酸突变。示意图显示了预测的miR-193a-3p结合位点RASSF1系统-3′UTR（粗体）和突变（下划线）。(B)miR-193a-3p在miR-control或miR-193a-3p模拟转染HeLa细胞中表达的定量48 转染后h。Rassf1的量化(C类)mRNA和(D类)HeLa、OVCAR-8和HCT116细胞系中的蛋白表达48 miR-control或miR-193a-3p转染后h，以及(E类)Rassf1蛋白在HeLa细胞中的表达48 在miR对照或抗miR-193a-3p转染后h。显示了具有代表性的免疫印迹。所有数据均来自两个或三个独立实验（平均值±标准差）。
图3
图3
miR-193a-3p过量会损害胞质分裂。(A类)用miR-control或miR-193a-3p转染的同步HeLa细胞的活细胞膜的代表性静止图像。时间为h : 从双胸苷阻断释放后分钟。箭头指向分裂细胞，细胞分裂正常（miR-control）或失败（miR-193a-3p）。比例尺等于25 μm.条形图显示了有丝分裂细胞在胞质分裂中失败的百分比。数据来自HeLa和OVCAR-8细胞系的三个独立实验(n个=每类300个单元格）。(B)一个有代表性的活细胞成像实验的散点图(n个=100个细胞/组），用miR-control或miR-193a-3p转染HeLa细胞，显示有丝分裂持续时间（min；NEBD到后期，平均值±s.d.）和每个记录细胞的命运。每个细胞呈菱形，灰色表示细胞分裂失败。(C类)miR-control或miR-193a-3p转染HeLa细胞固定后的代表性显微照片48 转染后h。箭头表示miR-193a-3p转染人群中双核（II）、三核（III）和四核（IV）间期细胞异常。三个实验的量化结果表明，miR-193a-3p过度表达HeLa和OVCAR-8细胞群中多核间期细胞的频率增加（平均值±标准差。；n个>与miR-对照组相比，每组1500个细胞）。比例尺为25 μ米。
图4
图4
miR-193a-3p过量会干扰Stx16蛋白的表达和定位。Stx16的量化(A类)mRNA和(B)HeLa细胞中的蛋白质表达48 miR-control或miR-193a-3p转染后h。显示了Stx16蛋白表达的典型免疫印迹图像。(C类)转染miR-control或miR-193a-3p并用Stx16抗体染色的固定间期HeLa细胞的代表性免疫荧光图像。DAPI描述了DNA，比例尺为20 μm.定量分析表明，与miR-对照转染细胞相比，Stx16信号在miR-193a-3p过度表达细胞中分散到更大的区域。(D类)晚期M期固定HeLa细胞的代表性免疫荧光图像，转染miR-control或miR-193a-3p并用Stx16（红色）和tubulin（绿色）抗体染色48 转染后h。DNA用DAPI染色。比例尺为10 μm.图显示了早期末期细胞中体Stx16信号强度的量化(n个>每组50个细胞），转染miR-control或miR-193a-3p。所有量化均来自三个独立的实验（平均值±标准差）。此图的全彩版本可在英国癌症杂志在线期刊。
图5
图5
miR-193a-3p的过度表达诱导多极有丝分裂纺锤体，导致M期细胞的积聚和细胞死亡。(A类)miR-对照或miR-193a-3p转染有丝分裂HeLa细胞的代表性免疫荧光图像，固定48 转染后h，用抗体染色α-微管蛋白（绿色）和中心蛋白（红色）。DNA用DAPI染色。比例尺等于10 μm.量化显示miR-193a-3p过度表达细胞群中多极纺锤体有丝分裂细胞的百分比增加(n个=每组150个细胞）。(B)中心蛋白分析，α-微管蛋白和中心蛋白3免疫染色的HeLa细胞显示在miR-193a-3p过度表达的细胞群中存在两种多极纺锤体及其相对频率；多极有丝分裂细胞，其中每个极都有中心粒，多极有核分裂细胞中一个或多个极对中心蛋白-3染色呈阴性(n个=每组150个细胞）。(C类)条形图显示了miR-control和miR-193a-3p转染HeLa细胞48的有丝分裂和细胞死亡指数的量化 转染后h(n个>每组1500个细胞）。所有量化都来自三个独立的实验，数据为平均值±标准差。该图的全色版本可在英国癌症杂志在线期刊。
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