Polo-like-kinase 1 is a proviral host factor for hepatitis B virus replication

doi:10.1002/hep.29236

.2017年12月；66(6):1750-1765.

doi:10.1002/hep.29236。 Epub 2017年11月6日。

Polo-like kinase 1是乙型肝炎病毒复制的前病毒宿主因子

附属公司

¹INSERM U1052，法国里昂里昂癌症研究中心。
²里昂大学，克劳德·伯纳德大学，UMR_S1052，UCBL，里昂，法国。
^三印第安纳州西拉斐特普渡大学基础医学系和普渡癌症研究中心。
⁴CIRI-国际传染病研究中心，EVIR团队，INSERM，U1111，里昂大学Claude Bernard Lyon 1，CNRS，UMR5308，里昂国立大学，里昂，法国里昂。
⁵法国里昂市里昂公民收容所克罗克斯-鲁斯医院肝肠病学室。
⁶法国里昂Labex DEVweCAN。

PMID： 28445592
预防性维修识别码： PMC5658273
内政部： 2002年10月10日/1923年9月2日

Polo-like kinase 1是乙型肝炎病毒复制的前病毒宿主因子

艾哈迈德·迪亚卜等。肝病学. 2017年12月.

.2017年12月；66（6）：1750-1765。

doi:10.1002/hep.29236。 Epub 2017年11月6日。

附属公司

¹INSERM U1052，法国里昂里昂癌症研究中心。
²里昂大学，克劳德·伯纳德大学，UMR_S1052，UCBL，里昂，法国。
^三印第安纳州西拉斐特普渡大学基础医学系和普渡癌症研究中心。
⁴CIRI-国际传染病研究中心，EVIR团队，INSERM，U1111，里昂大学Claude Bernard Lyon 1，CNRS，UMR5308，里昂国立大学，里昂，法国里昂。
⁵法国里昂市里昂公民收容所克罗克斯-鲁斯医院肝肠病学室。
⁶法国里昂Labex DEVweCAN。

PMID： 28445592
预防性维修识别码： PMC5658273
内政部： 10.1002/庚29236

摘要

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝细胞癌（HCC）的主要危险因素，目前对慢性乙型肝炎和HCC的治疗并不理想。在此，我们确定细胞丝氨酸/苏氨酸Polo-like激酶1（PLK1）是HBV复制的积极效应器。本研究的目的是证明PLK1在HBV生物合成中的前病毒作用，并验证抑制PLK1是一种潜在的抗病毒策略。为此，我们采用了原代人肝细胞（PHH）和分化的HepaRG细胞的生理相关HBV感染模型，以及药物PLK1抑制剂、小干扰RNA（siRNA）介导的敲除和组成活性PLK1（PLK1）的过度表达^{加利福尼亚州}). 此外，人性化的肝脏Fah^-/-/抹布2^-/-/Il2rg公司^-/-用FRG小鼠模型测定PLK1抑制剂BI-2536对HBV感染的体内抗病毒作用。最后，通过体外PLK1激酶检测和定点突变证明HBV核心蛋白（HBc）是PLK1底物。我们证明HBV感染激活PHH中的细胞PLK1并分化HepaRG细胞。BI-2536或siRNA-介导的敲除抑制PLK1抑制HBV DNA生物合成，而PLK1过度表达^{加利福尼亚州}增加，表明PLK1对病毒生物合成的影响是特异性的，并且PLK1是前病毒细胞因子。值得注意的是，BI-2536给药于HBV感染的人源化肝FRG小鼠可强烈抑制HBV感染，验证了PLK1是体内的抗病毒靶点。PLK1的前病毒作用与核衣壳的生物发生有关，因为BI-2536导致其细胞内形成/积累减少。在这方面，我们的研究在体外将HBc鉴定为PLK1底物，并绘制了该蛋白上的PLK1磷酸化位点。

结论：PLK1是一种前病毒宿主因子，可被设想为联合抗病毒和抗肿瘤策略的靶点，以对抗HBV感染和HBV介导的致癌作用。（《肝病学》2017；66:1750-1765）。

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利益冲突声明

利益冲突：

本研究无

数字

**图1。HBV感染激活PLK1**
dHepaRG细胞（A、B和C）或PHH（D）感染低剂量（100vge/cell）或高剂量（1000vge/ccell）HBV。A）在指定的时间点收获细胞，提取RNA并进行RT-qPCR。与模拟感染相比，PLK1和HBV mRNA表达水平的折叠诱导归一化为看家基因。B） PLK1和磷酸化PLK1（pPLK1-S）的免疫印迹₁₃₇和pPLK1-T₂₁₀)使用在感染后指定时间点分离的模拟或HBV感染的dHepaRG细胞的全细胞提取物（WCE）。使用ChemiDoc XRS+系统（Biorad）进行化学发光定量。C）免疫荧光显微镜观察不同时间dHepaRG细胞中指示蛋白+/−HBV感染。用2%PFA固定细胞，并用指示抗体染色。D）使用模拟或HBV感染的PHH细胞的WCE对PLK1和磷酸化PLK1进行免疫印迹。

**图2。BI-2536对非分裂和非转化dHepaRG中HBV复制的影响**
分化后的HepaRG细胞（A、B、C和D）感染100 vge/细胞的HBV 7天，然后增加PLK1抑制剂BI-2536的浓度治疗3天。A）从HBV感染dHepaRG细胞上清液中分泌的抗原HBsAg和HBeAg通过ELISA定量，第10天p.i.从感染细胞中提取的总RNA和DNA通过HBV特异性RT-qPCR或qPCR进行分析，归一化为看家基因，并与模拟处理的细胞进行比较。与未经处理的对照组相比，结果显示为表达或分泌的折叠变化，并且是至少3个独立实验的平均值±SEM。B）如图所示，使用细胞滴定Glo One溶液测定法测量HepaRG细胞的细胞活力，并增加BI-2536的浓度。以二甲基亚砜和嘌呤霉素为对照。C）感染dHepaRG细胞中指示蛋白+/-BI-2536的免疫荧光显微镜检查。D）与其他小组一样，模拟和感染的dHepaRG通过生化药物治疗（No Txt=不治疗；TFV=替诺福韦10μM；Bay41=Bay41-4109 10μM，AT130 10μM、BI-2536指定浓度）或通过靶向HBV（siHBV）或PLK1（siPLK1）的siRNA（25nM）转染3天。细胞裂解产物通过天然琼脂糖凝胶电泳进行分析，转移到ECL膜上，并用HBc抗体进行免疫印迹。（Di）免疫印迹图像，下面进行量化，（Dii）=使用ChemiDoc XRS+系统（Biorad）通过化学发光对2个独立实验进行量化。

**图3。BI-2536对未分化和未转化PHH中HBV复制的影响**
如图所示，PHH（A、B和C）感染100 vge/细胞HBV 4天，然后用增加浓度的PLK1抑制剂BI-2536治疗3天。A）使用第7天p.i.感染HBV的PHH上清液通过ELISA定量分泌的HBsAg和HBeAg。通过HBV特异性RT-qPCR或qPCR分析从HBV感染细胞（第7天p.i.）中提取的总RNA和DNA，并将其归一化为看家基因，并与模拟处理细胞进行比较。相对于未经治疗的对照组，定量表达或分泌的折叠变化代表至少3个独立实验的平均值±SEM。B）图中显示了具有代表性的Southern印迹（n=3）。第7天p.i.从细胞中提取的总DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，转移到尼龙膜上，并与前面描述的放射性HBV探针杂交⁽²²⁾.

**图4。PLK1敲除对dHepaRG和PHH中HBV复制的影响**
如图所示，用靶向PLK1（siPLK1）或HBV（siHBV）或HCV（siHCV）的siRNA（5或25 nM）转染感染100 vge/细胞HBV的PHH或dHepaRG细胞7天。A和C）提取总RNA和DNA，用PLK1或HBV引物进行RT-qPCR或qPCR。PLK1 mRNA和HBV DNA的定量与缺乏siRNA转染（无siRNA）有关。结果表示至少3个独立实验的平均值±SEM。B） HBV感染的dHepaRG细胞中指示蛋白的免疫荧光显微镜，+/−siPLK1转染。在第10天p.i.用2%PFA固定细胞，并用指示的抗体染色。D）图中显示了具有代表性的Southern印迹。从用指示的siRNA转染的感染的PHH中提取DNA。

**图5。BI-2536对人源化HBV感染FRG小鼠HBV复制的影响**
8只植入人PHH 2个月的小鼠感染了HBV（5.10e8 vge/只）。在第4周p.i.，按照指示开始治疗。每周两次腹腔注射BI-2536（10mg/kg），持续4周。在第1、2、4、6、7和8周末采集血液，用qPCR和ELISA监测病毒血症（A）和抗原血症（B和C）。通过qPCR、RTqPCR和cccDNA特异性qPCR分别对肝内HBV DNA（Di）、RNA（Dii）和cccDNA（Diii）进行定量⁽²⁷⁾.

**图6。BI-2536对人肝HBV感染FRG小鼠衣壳形成的影响**
免疫组织化学染色（A）和天然衣壳迁移分析（B）使用图5中相同小鼠的肝脏样本。A）用抗HBc抗体（Dako）和FAH抗体对非治疗和BI-2536治疗的肝脏进行代表性免疫组织化学染色。B）采用模拟处理FRG小鼠（小鼠编号M#1-M#4）和BI-2536处理动物（小鼠编号#M#5-M38）的提取物进行衣壳迁移试验。C）来自（B）的衣壳迁移信号的累积量化。

**图7。BI-2536与替诺福韦、IFN-α或Bay41-4109联合治疗**
分化后的HepaRG用100 vge/细胞的HBV感染7天，然后用指示浓度的药物治疗3天。A） ELISA法监测上清液中HBeAg的分泌。B）用qPCR定量细胞内HBV DNA。

图8。HBc是PLK1的磷酸化底物*在体外*
体外野生型（WT）HBc和定点突变体的PLK1激酶分析。A）从HepaRG-TR-HBc细胞分离的重组HBc或免疫亲和纯化HBc和PLK1用于*在体外*PLK1激酶分析。如图所示，在γ存在的情况下，使用（+）或不使用（−）PLK1抑制剂BI-2536（500nM）进行反应³²P-ATP，SDS-PAGE和放射自显影分析。B） HBc C末端结构域（CTD）的氨基酸序列。HBc CTD中存在8个S/T残留物。CDK2 SP位点用红色表示，PLK1磷酸化位点用蓝色表示。B、 C、D和E）体外如图所示，添加（+）或不添加（−）BI-2536的WT HBc和定点突变体的激酶测定。HBc 3A包含残基155、162和170的Ser到Ala替换。HBc 3D包含相同残基的Ser到Asp取代。显示了用于放射自显影的相同凝胶的柯马西蓝染色。ImageJ软件量化的相对强度是来自*在体外*激酶反应信号与commassie蓝染色带的相应信号，相对于WT表达（n=3）。

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中的注释

Polo-like kinase 1：抗HBV治疗的关键细胞靶点？
Lai MMC、Su WC。 Lai MMC等人。肝病学。2017年12月；66(6):1719-1721. doi:10.1002/hep.29407。Epub 2017年11月6日。肝病学。2017 PMID：28749534 没有可用的摘要。

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[8] Seeger C、Zoulim F、Mason WS。乙型肝炎病毒。在：Knipe DM，Howley PM，编辑。菲尔德病毒学。第2卷。费城：Lippincott Williams&Wilkins；2015年，第2185页。

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