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.2017年6月13日;8(24):39323-39344.
doi:10.18632/目标16950。

三叶因子3介导肝细胞癌的致癌性和化疗耐药性依赖于AKT-BCL-2

附属公司

三叶因子3介导肝细胞癌的致癌性和化疗耐药性依赖于AKT-BCL-2

你明亮等。 Oncotarget公司. .

摘要

肝细胞癌(HCC)的有效治疗仍然是一个挑战,部分归因于固有的化疗耐药性。以前的报告已经观察到肝癌中TFF3表达增加。在此,我们研究了TFF3在肝癌进展中的功能作用,以及在固有和获得性化疗耐药中的作用。在肝癌中观察到TFF3表达上调,并与不良的临床病理特征和较差的患者生存结果相关。在功能上,肝癌细胞系中TFF3的强制表达增加了细胞增殖、细胞存活、锚定非依赖性和3D基质凝胶生长、细胞侵袭和迁移以及体内肿瘤生长。相反,如上述参数所示,TFF3表达减少降低了肝癌细胞的致瘤性。此外,TFF3的强制表达降低了肝癌细胞对阿霉素的敏感性,这归因于阿霉素外排增加和Hep3B细胞的肿瘤干细胞样行为。相反,TFF3的缺失增加了阿霉素敏感性,降低了Hep3B细胞的癌干细胞样行为。相应地,TFF3在获得性阿霉素耐药的Hep3B细胞中的表达显著增加,而TFF3的耗竭导致Hep3B细胞对阿霉素的再敏感性。观察到阿霉素耐药Hep3B细胞的阿霉素外排增加和肿瘤干细胞样行为增强依赖于TFF3的表达。此外,我们确定,TFF3刺激的肝癌细胞的致癌性和化疗耐药性是通过BCL-2的AKT依赖性表达介导的。因此,TFF3的治疗性抑制应被视为阻碍HCC的进展,并克服HCC的内在和获得性化学耐药性。

关键词:TFF3;肿瘤干细胞;耐药;肝细胞癌;致癌的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

PEL和TZ之前曾咨询过Perseis Therapeutics Ltd.。PEL也在PCT申请编号WO 2006/69253、WO/2008/042435、WO/2009/147530和WO/2012/150869中命名,以及这些申请的衍生产品/国家阶段组件。MLY、YJC、QYC、MMW、VP、RMC、LL、LM和ZSW声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。TFF3表达与肝癌患者预后不良相关
(A)TFF3在邻近非肿瘤组织和HCC标本中的IHC染色。棕色表示TFF3染色。用苏木精对所有样品进行复染,并在×100倍放大下拍摄图像。(B)肝癌和邻近非肿瘤组织标本中TFF3表达的统计分析。(C)肝癌患者TFF3表达与临床病理特征的相关性。(D)肝癌患者RFS和OS中TFF3表达的意义分析。OS:总生存率;RFS:无复发生存率。
图2
图2。TFF3的强制表达促进Hep3B细胞的致瘤性
用含有TFF3基因的表达载体(命名为Hep3B-TFF3)或单独的pIRESneo3载体(Hep3B-Vec)稳定转染Hep3B细胞。(A)用RT-PCR和western blot检测TFF3的表达,以βACTIN作为输入对照。(B)添加10%或0.2%FBS的DMEM培养基中7天内的总细胞数计数。(C)BrdU掺入分析。(D)细胞周期分析。(E)细胞凋亡检测。24小时血清剥夺后凋亡细胞核的百分比如直方图所示。(F)24小时血清剥夺后Caspase 3/7活性。(G)软琼脂集落形成。柱状图中显示了菌落数。(H)Foci形成。(一)细胞迁移分析。(J)细胞侵袭试验。穿透跨阱膜的细胞数量。(K)3D Matrigel增长。细胞活力如柱状图所示。(左) 体内肿瘤形成。每3天测量一次肿瘤体积,直到6周。数据表示为平均值±S。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001.
图3
图3。TFF3表达缺失降低Hep3B细胞的致瘤性
用含有TFF3 siRNA基因的表达载体(指定为Hep3B-siTFF3)或单独的pSilencer载体(Hep3B-siVec)稳定转染Hep3B细胞。(A)用RT-PCR和蛋白质印迹检测TFF3的表达,β-肌动蛋白作为输入对照。(B)添加10%或0.2%FBS的DMEM培养基中7天内的总细胞数计数。(C)BrdU掺入分析。(D)细胞周期分析。(E)细胞凋亡检测。24小时血清剥夺后凋亡细胞核的百分比如直方图所示。(F)24小时血清剥夺后Caspase 3/7活性。(G)软琼脂集落形成。柱状图中显示了菌落数。(H)病灶形成。(一)细胞迁移分析。(J)细胞侵袭试验。穿透跨阱膜的细胞数量。(K)3D Matrigel增长。细胞活力如柱状图所示。(左) 体内肿瘤形成。每3天测量一次肿瘤体积,直到6周。数据表示为平均值±S。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001; #, 没有意义
图4
图4。TFF3降低肝癌细胞的化疗敏感性并促进CSC样特性
(A)IC50用非线性回归法测定和分析Hep3B中阿霉素的含量。(B)阿霉素在Hep3B细胞中的流出和积累。(C)耐药相关基因的q-PCR分析。维拉帕米用于阻断ABC膜转运蛋白挤出阿霉素。(D)球体形成。直方图中显示了Hep3B-Vec、-TFF3、siVec和-siTFF3细胞形成的球体数量。(E)Hep3B-TFF3和Hep3B-Vec传代到G3后的球体形成能力。(F)Hep3B-siTFF3和Hep3B-siVec传代到G3后的球体形成能力。(G)用流式细胞术测定Hep3B-Vec、-TFF3、siVec和-siTFF3细胞中的副产物百分比。维拉帕米用于抑制ABC膜转运体挤压Hoechst 33342染料,以建立鉴定流出Hoechst33342染色的侧群细胞的基线。(H)用流式细胞术分析Hep3B-Vec、-TFF3、siVec和-siTFF3细胞中ALDH+细胞的百分比。细胞与ALDEFLOUR底物孵育以确定ALDH+细胞,而DEAB是ALDH1A1亚型的特异性抑制剂,用于确定基线荧光。数据以平均值±S表示。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001; #, 没有意义。
图5
图5。TFF3通过Hep3B细胞中AKT激活介导的BCL-2依赖性方式促进致癌性和CSC样特性
用含TFF3基因的表达载体(指定为Hep3B-TFF3)或单独的pIRESneo3载体(Hep3B-Vec)、TFF3 siRNA基因(指定为Hep3B-siTFF3,或单独的p Silencer载体(Hep 3B-siVec)稳定转染Hep3B细胞。(A)TFF3的表达调节BCL2启动子的活性。(B)蛋白表达检测采用western blot,β-肌动蛋白作为输入对照。(C)YC137处理后使用Caspase 3/7活性进行细胞凋亡检测。(D)YC137处理后3D Matrigel生长。细胞活力如柱状图所示。(E)YC137处理后球体形成。柱状图中显示了球体的数量。(F)检测AKT抑制剂V治疗后的蛋白表达,β-肌动蛋白作为输入对照。(G)AKT抑制剂V治疗后用Caspase 3/7活性检测细胞凋亡。(H)AKT抑制剂V治疗后3D Matrigel生长。细胞活力如柱状图所示。(一)AKT抑制剂V治疗后球体形成。柱状图中显示了球体数量。数据表示为平均值±S。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001,第页< 0.001; #, 没有意义。
图6
图6。阿霉素耐药的Hep3B细胞表现出TFF3表达增加和CSC样特性
用IC培养基培养耐药细胞50阿霉素浓度(指定为Hep3B-Dox细胞)。在选择期间,将对照细胞培养在含有DMSO的培养基中(指定为Hep3B-Ctl细胞)。(A)用western blot检测Hep3B-Dox细胞中TFF3表达的增加。(B)阿霉素在Hep3B-Dox细胞中的流出和积累。(C)Hep3B-Dox细胞耐药基因表达的q-PCR分析。(D)球体形成。Hep3B-Ctl和–Dox细胞形成的球体数量如柱状图所示。(E)通过流式细胞术测定Hep3B-Ctl和-Dox细胞中副群的百分比。维拉帕米用于抑制ABC膜转运体挤压Hoechst 33342染料,以建立鉴定流出Hoechst33342染色的侧群细胞的基线。(F)采用流式细胞术分析Hep3B-Ctl和–Dox细胞中ALDH+细胞的百分比。细胞与ALDEFLOUR底物孵育以确定ALDH+细胞,而DEAB是ALDH1A1亚型的特异性抑制剂,用于确定基线荧光。数据表示为平均值±S。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001; #, 没有意义。
图7
图7。TFF3耗竭增加阿霉素应答并降低阿霉素耐药Hep3B细胞的类CSC特性
(A)用siTFF3瞬时转染Hep3B-Dox测定其化学敏感性。用AlamarBlue测定细胞活力。(B)用western blot检测Hep3B-Dox细胞中TFF3、AKT活化(Ser473)和BCL-2的表达。(C)球体形成。直方图中显示了Hep3B-Ctl和–Dox细胞±siTFF3形成的球体数量。(D)用流式细胞术测定Hep3B-Ctl和–Dox细胞±siTFF3中的副产物百分比。维拉帕米用于抑制ABC膜转运体挤压Hoechst 33342染料,以建立鉴定流出Hoechst33342染色的侧群细胞的基线。(E)采用流式细胞术分析Hep3B-Ctl和–Dox细胞±siTFF3中ALDH+细胞的百分比。细胞与ALDEFLOUR底物孵育以确定ALDH+细胞,而DEAB是ALDH1A1亚型的特异性抑制剂,用于确定基线荧光。数据表示为平均值±S。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001.
图8
图8。抑制AKT增加阿霉素反应并降低阿霉素耐药Hep3B细胞的类CSC特性
(A)用AKT抑制剂V处理Hep3B-Dox细胞,测定其化学敏感性。用阿拉玛蓝测定细胞活力。(B)使用蛋白质印迹测量Hep3B-Dox细胞中的TFF3、AKT活化(Ser473)和BCL-2表达。(C)球体形成。直方图显示了用5μM AKT抑制剂V或DMSO载体处理的Hep3B-Ctl和Hep3B-Dox细胞形成的球体数量。(D)用流式细胞术分析用5μM AKT抑制剂V或DMSO载体处理的Hep3B-Ctl和Hep3B-Dox细胞中的副产物百分比。维拉帕米用于抑制ABC膜转运体挤压Hoechst 33342染料,以建立鉴定流出Hoechst33342染色的侧群细胞的基线。(E)用流式细胞术分析用5μM AKT抑制剂V或DMSO载体处理的Hep3B-Ctl和Hep3B-Dox细胞中ALDH+细胞的百分比。细胞与ALDEFLOUR底物孵育以确定ALDH+细胞,而DEAB是ALDH1A1亚型的特异性抑制剂,用于确定基线荧光。数据表示为平均值±S。E.M.*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001.

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引用人

工具书类

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