Calreticulin Is Required for TGF-β-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition during Cardiogenesis in Mouse Embryonic Stem Cells

doi:10.1016/j.stemcr.2017.03.018

.2017年5月9日；8(5):1299-1311.

doi:10.1016/j.stemcr.2017.03.018。 Epub 2017年4月20日。

在小鼠胚胎干细胞心脏发生过程中，钙网蛋白是TGF-β诱导的上皮-间充质转化所必需的

费雷斯特·卡里姆扎德¹, 米查尔·奥帕斯²

附属公司

¹多伦多大学实验医学和病理生物学系，多伦多，ON M5S 1A8，加拿大。
²多伦多大学实验医学和病理生物学系，多伦多，ON M5S 1A8，加拿大。电子地址：m.opas@utoronto.ca。

PMID： 28434939
PMCID公司： PMC5425659
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.03.018

在小鼠胚胎干细胞心脏发生过程中，钙网蛋白是TGF-β诱导的上皮-间充质转化所必需的

费雷斯特·卡里姆扎德等。干细胞报告. 2017.

.2017年5月9日；8(5):1299-1311.

doi:10.1016/j.stemcr.2017.03.018。 Epub 2017年4月20日。

作者

费雷斯特·卡里姆扎德¹, 米查尔·奥帕斯²

附属公司

¹多伦多大学实验医学和病理生物学系，多伦多，ON M5S 1A8，加拿大。
²多伦多大学实验医学和病理生物学系，多伦多，ON M5S 1A8，加拿大。电子地址：m.opas@utoronto.ca。

PMID： 28434939
PMCID公司：下午52425659
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.03.018

摘要

钙网蛋白是一种多功能内质网驻留蛋白，是TGF-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）和随后的心肌发生所必需的。利用来源于钙网蛋白-完整和野生型（WT）胚胎干细胞（ESCs）的类胚体（EBs），我们发现EMT和心脏分化标记物的表达是在WT EBs分化过程中诱导的。这种诱导在缺乏钙网蛋白的情况下被抑制，并且可以通过抑制WT细胞中的TGF-β信号来模拟。WT细胞中钙网蛋白的存在允许TGF-β通过AKT/GSK3β介导信号传导，并促进SNAIL2/SLUG对E-cadherin的抑制。这与N-钙粘蛋白在一个称为钙粘蛋白开关的过程中的诱导平行。我们证明调节钙²⁺钙网蛋白和钙调神经磷酸酶之间的信号传导对于未减弱的TGF-β信号传导至关重要，这是EMT期间退出多能性和钙粘附素转换所必需的。因此，钙网蛋白是TGF-β诱导小鼠ESCs心肌发生的关键介质。

关键词：EMT；转化生长因子-β；钙粘蛋白；钙网蛋白；心脏分化。

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数字

图1
钙网蛋白缺乏损害小鼠ES细胞体外心脏分化（A）WT、CRT-KO和CN细胞心脏分化过程中EB的功能分析。与CRT-KO相比，WT和CN EB开始搏动更早，并且在整个分化过程中WT和CN EB的搏动百分比更高。在分化的第3天（D3）、第5天（D5）、第10天（D10）和第14天（D14）对跳动的EB进行计数。（B）使用D14 WT、CRT-KO和CN EB上的抗心肌肌钙蛋白I（Alexa Fluor 488）抗体，以与WT EB中的一级抗体相同的浓度和条件使用兔单克隆IgG（Alexa-Fuoro 488）作为对照，通过细胞内流式细胞术定量心脏标记蛋白的表达。代表性图分析对应于x轴488 nm处的荧光强度，y轴对应于活细胞计数。该图显示了平均荧光强度（MFI），条形图表示三个单独实验值的SEM。（C） Western blot分析显示WT和CRT-KO细胞分化过程中心肌MHC蛋白水平升高。（D）条形图显示了三个独立实验中心脏MHC带密度与GAPDH的定量关系。（E） qPCR分析显示心脏标志物的mRNA表达*网格1*,*Gata4公司*、和*Nkx2-5个*在分化的D0、D5、D10和D14处收集RNA样本。所有qPCR结果均归一化为L32的表达水平，以WT多能干细胞（D0）为参考，即1。qPCR数据是三个单独实验的平均值；^∗p≤0.05，^∗∗p≤0.01，^∗∗∗p≤0.001，^∗∗∗∗p≤0.0001。

图2
钙网织蛋白缺失在EMT过程中影响E-钙粘蛋白/N-钙粘蛋白转换（A）蛋白质印迹分析显示，在D0、D3、D5、D7、D10和D14分化过程中，E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白在WT和CRT-KO细胞中的表达。在WT细胞中，E-cadherin在分化过程中减少，而N-cadherin增加。E-cadherin在CRT-KO细胞中的表达很高，并且在整个分化过程中保持较高水平，而N-cadherin的表达很低。这些图是N-和E-钙粘蛋白标准化的带密度与这些特殊的western blot的GAPDH的定量。（B） Western blot分析CN细胞中E-Cadhein和N-Cadherin的表达。（C） qPCR显示*N-卡德林*,*蜗牛2/鼻涕虫*、和*扭转1*分化过程中WT细胞中mRNA表达增加，CRT-KO细胞中表达较低，而*E-钙黏蛋白*CRT-KO细胞中mRNA水平较高。qPCR数据是三个单独实验的平均值；^∗p≤0.05，^∗∗p≤0.01，^∗∗∗∗p≤0.0001。

图3
钙网蛋白缺失降低GSK3β的S9磷酸化并影响SNAIL2/SLUG核转移（A）qPCR分析显示TGF-β受体标记物的mRNA表达*TgfbR1型*,*TgfbR2型*、和*TgfbR3型*分化过程中WT和CRT-KO细胞中。（B） western blot分析检测WT、CRT-KO和CN细胞在心脏分化D14时从总细胞裂解物中分化出的心肌细胞中的N-钙粘蛋白、E-钙粘素、pAKT（S473）和pGSK3β（S9）与总GSK3α和总AKT的对比。与含钙网蛋白的WT细胞相比，KO细胞中E-钙粘蛋白更丰富，而相比之下，N-钙粘蛋白在WT细胞中比钙网蛋白缺乏的KO细胞更丰富。CN细胞表达较少的E-cadherin和较多的N-cadherin。CRT-KO细胞丝氨酸473处的AKT磷酸化和S9处的GSK3β磷酸化较低。条形图显示了三个独立实验中E-cad/N-cad、pAKT和pGSK3β带密度与GAPDH的定量关系；^∗p≤0.05，^∗∗p≤0.01，^∗∗∗p≤0.001，^***p≤0.0001。（C） D10和D14心脏分化期间WT、CRT-KO和CN细胞核组分中SNAIL2/SLUG的Western blot检测。

图4
抑制TGF-β可损害小鼠ESC心脏分化过程中的E-Cadherin/N-Cadherin开关（A）GSK3β抑制剂（SB415286）和TGF-？抑制剂（SB431542）对D3-D5治疗后分化第14天WT和CRT-KO细胞E-和N-Cadherin表达的影响。（B）该图显示了左侧所示印迹的归一化到GAPDH的条带密度的量化。文本中有更多详细信息。结果是每个条件下至少三个独立实验的平均值；误差条，SD。^∗p≤0.05，^∗∗p≤0.01。（C）用抗E-cadherin和抗N-cadherin抗体标记的分化第14天EB的双标签共焦显微镜。在成像过程中，显微镜设置在所有条件下保持一致。比例尺，10μm。

图5
在无钙网蛋白的情况下抑制GSK3β诱导GATA4表达（A）Western blot分析表明，与分化第14天的含钙网蛋白细胞（WT）和钙调神经磷酸酶过表达细胞（CN）相比，在无钙网络蛋白（CRT-KO）的情况下，GATA4的表达较低。（B） Western blot检测D10和D14心脏分化期间WT、CRT-KO和CN细胞核部分的GATA4。（C）和（D）显示的qPCRGata4公司D14的mRNA。（C）在WT细胞中，GSK3β抑制不会显著影响*Gata4公司*mRNA，而TGF-β抑制显著降低其丰度。（D）在CRT-KO细胞中，GSK3β抑制显著增加了*Gata4公司*mRNA，而TGF-β抑制显著降低。结果是三个独立实验的平均值。^∗∗∗p≤0.001，^∗∗∗∗p≤0.0001。

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