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.2017年5月2日；8(18):30235-30251.
doi:10.18632/目标15750。

光交联GelHA水凝胶和crizotinib壳聚糖微球对软骨退行性变的改善作用

陈鹏飞 1 2, 盛美 1 2, 陈霞 1 2, 任柱 三, 庞宜川 4, 王吉英（Jiying Wang） 1 2, 张剑锋 1 2, 邵芳春 5, 顺武扇 1 2
附属公司

光交联GelHA水凝胶和crizotinib壳聚糖微球对软骨退行性变的改善作用

陈鹏飞等。 Oncotarget公司. .

摘要

本研究旨在探讨壳聚糖微球和光交联水凝胶包裹的克雷唑替尼对减少软骨血管生成的协同治疗作用，以评估克雷唑替尼治疗骨关节炎的疗效。首先，我们开发并评估了水凝胶和壳聚糖微球的特性。接下来，我们测量了克里唑替尼对软骨细胞中白细胞介素-1β诱导的软骨变性的影响。Crizotinib通过其抗血管生成功能改善白细胞介素-1β诱导的病理变化。此外，我们通过手术在小鼠体内诱导了骨关节炎，然后在小鼠关节内注射了负载crizotinib的生物材料。术后评估软骨基质降解、血管内皮生长因子和细胞外信号调节激酶1/2的表达。联合使用负载crizotinib的生物材料治疗可延缓手术诱发的骨关节炎的进展。Crizotinib通过促进抗血管生成和阻止细胞外信号调节激酶1/2信号通路改善软骨基质降解。我们的结果表明，光交联水凝胶和载crizotinib的壳聚糖微球的结合可能是治疗骨关节炎的一种有前景的策略。

关键词：血管生成；水凝胶；骨关节炎。

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利益冲突

作者没有利益冲突需要声明。

数字

图1
图1。GelHA水凝胶的制备与表征
（A）甲基丙烯酸明胶（GelMA）和甲基丙烯酸透明质酸（HAMA）水凝胶的分子结构和聚合物前体的合成。（B）水凝胶的微观结构（低倍和高倍）。（C）水凝胶的溶胀动力学。n＝3，*p＜0.05（单因素方差分析）。（D） 体外水凝胶的降解曲线。n=3，*p<0.05（单向方差分析）。（E）水凝胶的压缩模量。n=3，*p<0.05（单向方差分析）。GelHA水凝胶，含有GelMA和HAMA两种成分的混合水凝胶。
图2
图2。体外壳聚糖微球中克里唑替尼的释放
（A）克唑替尼壳聚糖微球的扫描电子显微照片。（B）壳聚糖微球的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。（C）克里佐替尼的吸收曲线。（D）克里佐替尼标准曲线。（E）壳聚糖微球的控释特性。
图3
图3。人OA患者和手术诱导OA小鼠软骨组织中VEGF的表达
（A）正常和OA人软骨标本中VEGF阳性细胞的免疫荧光染色和定量。比例尺=100μm。（B）正常和OA小鼠软骨样本中VEGF阳性细胞的免疫荧光染色和定量。比例尺=100μm。n=3，*p<0.05（学生t吨-测试）。（C）人OA和正常软骨中VEGF水平的Western blot分析（显示裁剪的斑点）。n=3，*p<0.05（学生t吨-测试）。（D）Western blot分析IL1β（10 ng/mL）处理人OA软骨细胞时的VEGF水平，并测量VEGF带的相对密度（显示裁剪的印迹）。n=3，*p<0.05（学生t吨-测试）。
图4
图4。克里佐替尼对IL1-β刺激软骨细胞的影响
（A）用IL1β（10 ng/mL）治疗48小时后，克里佐替尼（10μM）对MMP13、COL2A1、ADAMTS-5和聚集蛋白聚糖mRNA转录水平的影响。n=3，*p<0.05（单向方差分析）。（B）用克里唑替尼治疗后MMP13、COL2A1、ADAMTS-5、aggrecan和VEGF蛋白表达水平的Western blot分析[显示有或没有IL1β（10 ng/mL）刺激，裁剪的blot]。（C）软骨细胞中VEGF的免疫细胞化学检测。比例尺=30μm。（D）用茜素红染色观察克雷佐替尼对软骨细胞钙化的影响。比例尺=30μm。n=3，*p<0.05（学生t吨-测试）。
图5
图5。克里佐替尼对关节软骨基质变性的影响体外模型
（A、B）通过藏红花素O染色检测，Crizotinib显著减轻了IL-1β诱导的软骨蛋白聚糖的丢失。软骨样本取自无OA病史的人类受试者尸检后，用10 ng/mL IL-1β在有或无10μM克里唑替尼的情况下培养。比例尺=100μm。n=3，*p<0.05（单向方差分析）。（C）克里佐替尼对MMP13、COL2A1、ADAMTS-5和aggrecan mRNA转录水平的影响。n=3，*p<0.05（单向方差分析）。（D、E）进行免疫细胞化学以评估VEGF的表达。比例尺=100μm。n=3，*p<0.05（单向方差分析）。
图6
图6。载crizotinib的壳聚糖微球与GelHA水凝胶联合治疗OA的疗效
使用8周龄雄性C57BL/6小鼠。软骨样品的藏红O染色4（A）和8周（B）OA诱导后。比例尺=100μm。（C，D）OA诱导4周和8周后样本的OARSI评分。n=8，*p<0.05**p<0.01（Kruskal-Wallis方差分析）。I组，OA小鼠；Ⅱ组，用GelHA水凝胶和壳聚糖微球（不含克雷唑替尼）治疗OA小鼠；第三组，单独用克里唑替尼治疗OA小鼠；第四组，OA小鼠，用载crizotinib的壳聚糖微球和GelHA水凝胶治疗。
图7
图7。克里佐替尼对软骨基质降解的影响体内
（A）MMP13、COL2A1、ADAMTS-5和aggrecan的免疫组织化学（4周）。比例尺=100μm。（B、C、D、E）MMP13阳性的定量（B），COL2A1阳性（C），ADAMTS-5-阳性（D）和聚集蛋白聚糖阳性细胞（E）术后4周软骨样本内。n=8，*p<0.05，**p<0.01（单向方差分析）。（F）MMP13、COL2A1、ADAMTS-5和aggrecan的免疫组织化学（8周）。比例尺=100μm。（G，H，I，J）MMP13阳性的定量（G），COL2A1阳性（H），ADAMTS-5-阳性（一）和聚集蛋白阳性细胞（J）手术后8周软骨样本内。n=8，*p<0.05，**p<0.01（单向方差分析）。
图8
图8。克里佐替尼对软骨细胞血管生成的影响体内
4天后对VEGF进行免疫细胞化学（A、B）或8周（C，D）.比例尺=100μm。n=8*p<0.05，**p<0.01（单向方差分析）。
图9
图9。克里佐替尼减少软骨基质降解的机制
（A）用IL1β（10 ng/mL）和克里唑替尼（10μM）刺激小鼠初级软骨细胞1小时后，免疫细胞化学检测ERK1/2和p-ERK1/2。比例尺=30μM。（B）IL1β治疗后小鼠原代软骨细胞ERK1/2信号转导的Western blot分析（显示裁剪的印迹）。（C）用免疫细胞化学方法检测经或不经克里唑替尼处理8周的OA小鼠软骨中ERK1/2和p-ERK1/2的表达。比例尺=100μm。（D）克里佐替尼在骨关节炎治疗中作用的拟议模型。
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