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.2017年3月21日;8(12):19354-19364.
doi:10.18632/目标15223。

分泌的GRP78激活EGFR-SRC-STAT3信号传导,并赋予肝癌细胞对索拉非尼的耐药性

附属公司

分泌的GRP78激活EGFR-SRC-STAT3信号传导,并赋予肝癌细胞对索拉非尼的耐药性

芮莉(Rui Li)等。 Oncotarget公司. .

摘要

获得性耐药是接受索拉非尼治疗的肝癌患者的常见现象,但获得性耐药的形成机制尚不清楚。在本研究中,我们发现在HCC患者的血清样本和多个HCC细胞系的条件培养基中可以检测到GRP78,表明GRP78是由HCC细胞分泌的。进一步研究表明,分泌的GRP78促进了肝癌细胞株和肿瘤异种移植物中索拉非尼的增殖并抑制了其诱导的凋亡。我们进一步发现,分泌的GRP78可以与EGFR发生物理性相互作用,从而激活EGFR信号通路。EGFR的敲除降低了分泌型GRP78诱导的SRC和STAT3磷酸化。相反,EGFR的过度表达进一步增强了分泌型GRP78诱导的SRC和STAT3的磷酸化,表明EGFR在分泌型GRP 78中的关键作用使其对索拉非尼产生耐药性。此外,PP2对SRC的抑制可对抗索拉非尼的耐药性,并抑制分泌型GRP78对STAT3的激活。总之,我们的结果表明,分泌的GRP78可以与EGFR相互作用,激活EGFR-SRC-STAT3信号传导,赋予索拉非尼耐药性。

关键词:EGFR;组78;STAT3;肝细胞癌;索拉非尼。

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利益冲突声明

利益冲突

提交人声明,不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。GRP78由HCC细胞分泌
(一个)肝癌患者血清GRP78的ELISA分析。(B类)肝癌细胞中GRP78分泌的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。(C类)使用GRP78特异性抗体对缺乏条件培养基的GRP78进行SDS-PAGE分析。(D类)索拉非尼对GRP78分泌影响的SDS-PAGE和western blot分析。
图2
图2。分泌的GRP78促进肝癌细胞增殖并抑制肝癌细胞对索拉非尼的敏感性在体外
(一个)分泌型GRP78对肝癌细胞增殖影响的MTT分析。实验重复三次,共三次。数值表示为平均值±SD(B类C类)MTT分析分泌型GRP78对肝癌细胞短期(48小时)索拉非尼敏感性的影响。实验重复三次,共三次。数值表示为平均值±SD(D类)流式细胞术分析分泌型GRP78对索拉非尼诱导的细胞凋亡的影响。凋亡状态以凋亡细胞百分比(%)表示。(E类)长期(14天)分泌型GRP78对肝癌细胞增殖和索拉非尼敏感性影响的集落形成分析。实验重复三次,一式三份。
图3
图3。分泌的GRP78促进肝癌细胞增殖并抑制肝癌细胞对索拉非尼的敏感性体内
(一个)分泌型GRP78促进BALB/C小鼠异种移植瘤生长并减轻索拉非尼诱导的生长抑制(N个=每组5)。(B类)用rhGRP78、索拉非尼和rhGRP78/sorafenib治疗的小鼠异种移植物重量的定量分析(单位:g)。(C类)IHC分析用rhGRP78、索拉非尼和rhGRP78/sorafenib治疗的小鼠异种移植物中Ki67、p-EGFR和p-SRC的表达。(比例尺:200μM)。
图4
图4。分泌型GRP78与EGFR物理交互并激活EGFR下游信号
(一个)分泌型GRP78对SMMC7721细胞酪氨酸和丝氨酸磷酸化作用的Western blot分析。(B类)rhGRP78处理的SMMC7721细胞中细胞表面受体酪氨酸激酶的磷酸化RTK筛选。(C类)EGFR下游信号分子磷酸化状态的Western blot分析,包括AKT、SRC、STAT3、MEK和ERK(D类)rhGRP78、索拉非尼、rhGRP78/索拉非尼处理的SMMC7721细胞中BRAF、CRAF、SRC和ERK磷酸化状态的蛋白质印迹分析。(E类)以GRP78为诱饵,酵母双杂交筛选SMMC7721细胞表面的结合伙伴。p53/SV40T作为阳性对照。(F类)以rhGRP78为诱饵对分泌型GRP78与EGFR相互作用的GST下拉分析。
图5
图5。EGFR决定肝癌细胞对索拉非尼的反应
(一个)多种肝癌细胞系EGFR表达的Western blot分析。(B类)用siEGFR转染的SMMC7721细胞中EGFR表达的蛋白质印迹分析。(C类)MTT分析rhGRP78对EGFR敲低SMMC7721细胞索拉非尼敏感性的影响。实验重复三次,共三次。数值表示为平均值±SD(D类). 转染Flag-EGFR的Hep3B细胞EGFR表达的Western blot分析。(E类)MTT分析rhGRP78对过度表达EGFR的Hep3B细胞索拉非尼敏感性的影响。实验重复三次,共三次。数值表示为平均值±SD(F类)EGFR击倒SMMC7721细胞中SRC和ERK磷酸化的Western blot分析。(G公司)过度表达EGFR细胞中SRC和ERK磷酸化的Western blot分析。
图6
图6。抑制SRC活性减弱分泌型GRP78诱导的索拉非尼耐药性
(一个)Western blot分析PP2预处理对rhGRP78诱导的STAT3和EGFR磷酸化的影响。(B类)MTT分析PP2预处理对短期(48小时)用rhGRP78处理的SMMC7721细胞对索拉非尼敏感性的影响。实验重复三次,一式三份。数值表示为平均值±SD(C类)长期(72小时)用rhGRP78处理SMMC7721细胞,研究PP2预处理对索拉非尼敏感性的影响。实验重复三次,共三次。

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