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.2017年5月1日；214(5):1471-1491.
doi:10.1084/jem.20161149。 Epub 2017年4月17日。

表观遗传调节剂CXXC5招募DNA去甲基化酶Tet2来调节pDC中TLR7/9诱导的IFN反应

马时欣 1 2, 小灵丸 三, 邓子厚 1, 雷氏 1, 郝聪芳 1, 周振元 4, 春洲 1, 一元坊 三, 刘京华 1, 泾阳 1, 夏晨 1, 李天天 1, 藏爱平 1, 尹世刚（Shigang Yin） 三, 李斌（Bin Li） 1, 乔尔·普拉马斯 5, 劳伦斯·查普罗 5, 张晓明 三, 徐国良 6, 吕宾江 三, 南沈 4, 熊四东 2, 高晓明 2, 张燕（音译） 三, 慧晓 7
附属公司

表观遗传调节剂CXXC5招募DNA去甲基化酶Tet2来调节pDC中TLR7/9诱导的IFN反应

马时欣等。 实验医学杂志. .

摘要

TLR7/9信号能够在病毒感染后立即在浆细胞样树突状细胞（pDCs）中产生大规模干扰素（IFN）反应，但表观遗传学调控在这一过程中的参与尚未被证明。在这里，我们报告锌指CXXC家族表观遗传调控因子CXXC5在pDC中高度表达，在TLR7/9-和病毒诱导的IFN应答中发挥关键作用。值得注意的是，CXXC5的基因消融导致CpG-containing island（CGI）异常甲基化Irf7型基因和稳态pDCs中IRF7表达受损。从机制上讲，CXXC5负责招募DNA去甲基化酶Tet2，以维持CGI亚群的低甲基化，这一过程与这些包含CGI的基因的活性组蛋白修饰和组成性转录相一致。因此，CXXC5缺陷小鼠损害了早期IFN反应，极易受到单纯疱疹病毒和水泡性口炎病毒的感染。总之，我们的结果确定CXXC5是pDC介导的抗病毒反应的一种新的表观遗传调节剂。

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数字

图1。
图1。
CXXC5在pDC中的表达和功能。（A） 分别从BMDM、巯基乙酸合法的腹腔巨噬细胞、Flt3L分化的pDCs、GM-CSF分化的BMDCs（cDCs）以及由抗CD3或抗CD19微球分离的脾T和B细胞中提取总mRNA。的相对表达式Cxxc5号机组结束Gapdh公司通过实时PCR进行测量，数据以平均值±SD表示。该实验进行了两次，结果相似。（B） 从Flt3L-pDCs、GM-CSF-cDCs、BMDMs、MEFs、脾T细胞和B细胞制备全细胞裂解物，并用抗CXXC5抗体进行Western blotting。该实验进行了两次，结果相似。（C） cDC百分比（CD11c你好，B220上的门控−CD3（CD3）−细胞）和pDC（B220+PDCA1（PDCA1）+CD11c公司整数)用流式细胞术分析脾脏中的cDC和pDCs总数。这个实验重复了三次，得到了类似的结果。数据以平均值±标准差表示。（D）脾pDCs（106细胞/ml）从WT和CXXC5纯化−/−老鼠(n个=4）感染HSV-1 24 h。用ELISA测定IFNα/β的产生。该实验重复了两次，显示了代表性数据（平均值±SD）（*，P<0.05，由Student’s分析t吨测试）。（E） WT和CXXC5−/−老鼠(n个=6）未感染或静脉感染HSV-1（5×106pfu/小鼠）9h，用FACS对脾细胞进行分类。总mRNA从105pDC（CD11c整数B220型+/PDCA1（PDCA1）+/Siglec-H公司你好)并通过实时PCR进行定量。该实验重复了两次，显示了代表性数据（***，P<0.001，由Student’s分析t吨测试）。（F） WT和CXXC5−/−老鼠(n个=3）未经治疗或静脉注射20µg CpG-A（与30µg DOTAP复合）处理6小时，并收集血清用于ELISA。该实验进行了三次，结果相似（*，P<0.05，由Student’s分析t吨测试）。
图2。
图2。
病毒和TLR7/9诱导WT和CXXC5基因表达−/−pDC。（A–D）2×105Flt3L分化的BM衍生pDC（CD11c整数B220型+CD11b型−)由FACS分类的病毒要么未经处理（UT），要么用HSV-1（MOI:1；A）、CpG-A（2µg/ml；B）、VSV（MOI:1；C）或R848（1µg/ml；D）处理24小时，上清液(n个=3）收集用于ELISA。这些实验进行了三次，显示了代表性数据（平均值±SD）（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，由Student’s分析t吨测试）。（E） WT和CXXC5−/−通过慢病毒载体或表达CXXC5的慢病毒转导的（KO）Flt3L-pDC被FACS分选为GFP阳性细胞，并用CpG-A（2µg/ml）处理6 hIfnα/β和TnfαmRNA通过实时PCR定量，数据表示为平均值±SD。该实验重复两次，结果相似（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，由Student’s分析t吨测试）。
图3。
图3。
CXXC5对各种免疫细胞群中CpG-B和LPS诱导的信号传导的影响。（A–D）Flt3L-pDC（106/ml），脾B细胞（107/ml，通过抗CD19微珠纯化），GM-CSF–BMDCs（cDCs，106/ml）和BMDM（106/ml）被CpG-B（100 nM）刺激24小时，上清液(n个=3）收集用于ELISA。这些实验进行了三次，根据Student’st吨测试）。（E） 脾B细胞（107/ml）未经处理（UT）或用LPS（5µg/ml）处理48 h，并用ELISA测定分泌的细胞因子。该实验进行了两次，结果相似，数据表示为平均值±SD（**，P<0.01；***，P<0.001，Student’st吨测试）。（F） 骨髓间充质干细胞（cDC；106/ml）未经处理或用LPS（100 ng/ml）处理4小时Ifnα/β实时PCR分析趋化因子和细胞因子mRNA。该实验重复一次，数据以平均值±标准差表示。（G）来自WT和CXXC5的Flt3L分化pDC−/−用CpG-B（100 nM）刺激小鼠不同时间。细胞裂解物用10%SDS-PAGE溶解，并用指示的抗体进行探测。这个实验重复了两次。用CpG-B（100 nM）刺激（H和I）Flt3L-pDCs 2 H，用LPS（5µg/ml）或CpG-B（150 nM）处理脾B细胞2 H。交联和FACS分选后，制备细胞裂解物并用2µg抗p65免疫沉淀。通过实时PCR检测促炎基因的免疫沉淀启动子，并对各个输入进行量化(n个= 4). 这些实验重复了两次，显示了代表性数据（平均值±SD）（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，由Student’s分析t吨测试）。
图4。
图4。
CXXC5对pDC中CpG-A诱导的TLR9信号传导的影响。（A和B）来自WT和CXXC5的Flt3L-differentiated pDC−/−用CpG-A（2µg/ml）刺激小鼠不同时间。细胞裂解物用10%SDS-PAGE溶解，并用指示的抗体进行探测。这些实验重复了两次，结果相似。用CpG-A（ODN1585；2µg/ml）或IFNβ（100 U/ml）刺激（C和D）Flt3L-differentiated pDCs不同时间（C），并用R837（20µg/ml）或CpG-A（ODN2216；1µM）处理8名健康人PBMC中分离的人类pDCs 24 h（D）。这些实验重复了两次Cxxc5号机组通过实时PCR进行分析（平均值±SD；***，P<0.001）。（E） Flt3L分化的pDC未经处理（UT）或用CpG-A（2µg/ml）处理5 h。细胞用多聚甲醛固定，并依次用抗IRF7抗体（红色）和DAPI（蓝色）染色。该实验重复两次，图像由激光捕获共焦显微镜采集。棒材：（顶部）10µm；（底部）2µm。（F和G）Flt3L分化的pDC要么未经处理，要么用CpG-A（2µG/ml）处理2 h，然后用多聚甲醛交联。通过抗IRF7（3µg；F）或抗H4ac、抗H3K4me3和抗H3K27ac（1µg，g）对FACS分类的pDC进行ChIP裂解。通过实时PCR测量免疫沉淀的Ifnα4和Ifnβ启动子DNA片段，并对各自的输入进行量化。这些实验重复了两次，数据(n个=3，平均值±SD）t吨试验（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001）。
图5。
图5。
CXXC5调节pDC中的基因表达。（A） CXXC5中下调>1.5倍的三组基因的图示−/−通过微阵列分析比较pDC和WT pDC。四个不同组中每个基因的相对表达以对数表示2价值。（B） WT和CXXC5差异表达基因亚群的验证−/−实时PCR检测pDC。该实验进行了两次，数据（平均值±SD）由Student’st吨测试（**，P<0.01；***，P<0.001）。（C） 细胞裂解物由Flt3L分化的WT和CXXC5制备−/−（KO）pDC，并进行蛋白质印迹以检测转录因子的表达。这个实验重复了两次，结果相似。（D） Flt3-PDC未经处理（UT）或用CpG-A（2µg/ml）处理6 h，并通过实时PCR分析基因表达。这个实验进行了两次(n个=3），数据表示为平均值±SD。
图6。
图6。
Irf7基因CpG岛上的表观遗传修饰。（A） Flt3-PDC要么未经处理，要么用CpG-A（2µg/ml）处理3 h，通过Western blotting分析CXXC5的核质分布。这个实验重复了两次，结果相似。（B） Flt3L分化WT和CXXC5的细胞裂解物−/−（KO）pDC与抗CXXC5交联并免疫沉淀。丰富了Irf7型通过实时PCR测量启动子，并对各自的输入进行定量。这个实验重复了三次，数据(n个=4，平均值±SD）t吨试验（**，P<0.01）。TSS，转录起始位点。（C和D）来自Flt3L-pDCs（C）和GM-CSF-cDCs（D）的500 ng基因组DNA来自WT和CXXC5−/−用亚硫酸氢钠处理小鼠Irf7型（500-1000）通过PCR扩增并测序(n个= 10). 这个实验进行了两次。（E） 对Flt3L分化的pDC进行交联和超声处理，染色质片段用5hmC抗体进行免疫沉淀。基因启动子区5hmC水平Irf7型,Cxcl2公司、和Tnfα通过实时PCR定量(n个= 3). 该实验重复一次，数据表示为平均值±SD（***，P<0.001）。（F–H）Ezh2和Sin3a的富集和组蛋白修饰Irf7型CGI（500–1000；F和G）和pol II在Irf7型,Tnfα、和Cxcl2公司（H） 通过实时PCR定量pDC中的(n个= 3). 这些实验重复了两次，结果相似（数据由Student’st吨测试，以平均值±标准差表示；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001）。
图7。
图7。
CXXC5招募Tet2来调节pDC中Irf7 CGI的甲基化。（A） 细胞裂解物由WT和CXXC5制备−/−Flt3L-pDC和带有CXXC5抗体的免疫沉淀（IP）。免疫沉淀和输入分别用抗Tet2和抗CXXC5进行印迹。这个实验重复了一次。（B） Flt3L分化WT和CXXC5的全细胞裂解物−/−（KO）pDC通过对照IgG或抗Tet2交联和免疫沉淀。Tet2在不同区域的富集Irf7型通过实时PCR检测启动子(n个= 3). 这个实验重复了三次，数据（平均值±标准差）通过Student的t吨试验（**，P<0.01）。（C） WT和Tet2的基因组DNA−/−用亚硫酸氢钠处理Flt3L-pDCIrf7型（500–1000）通过PCR扩增并测序(n个= 10). 这个实验进行了两次。（D和E）Flt3L-differentiated pDCs被交联，并用所示抗体进行ChIP。组蛋白修饰（D）和Ezh2和Sin3a（E）在Irf7型通过实时PCR定量CGI（500–1000）(n个= 3). 这些实验重复了两次，数据由Student’st吨测试和表示为平均值±SD（*，P<0.05；***，P<0.001）。（F） Flt3L分化WT和Tet2的全细胞裂解物−/−pDCs用10%SDS-PAGE进行分离，并分别用抗IRF7和抗Tet2进行检测。这个实验重复了一次，结果相似。对（G和H）Flt3L分化的pDC进行交联和超声处理，并用所示抗体免疫沉淀染色质片段。基因启动子区5hmC水平（G）和pol II富集（H）Irf7型,Cxcl2公司、和Tnfα通过实时PCR定量(n个= 3). 这些实验重复两次，结果相似（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，由Student’s分析t吨测试和表示为平均值±SD）。
图8。
图8。
CXXC5系列−/−小鼠体内易受病毒感染。（A和B）6-8周龄WT和CXXC5−/−室友(n个=4）静脉感染HSV-1（5×106pfu/鼠标）。在6小时收集血清用于ELISA（A）或24小时收集血清进行菌斑试验（B）。这些实验重复了三次，数据由Student’st吨测试和表示为平均值±SD（*，P<0.05；**，P<0.01；ns，不显著）。（C） 6-8周WT和CXXC5−/−室友(n个=10）或CXXC5−/−老鼠(n个=10）采用1.2×10过户6Flt3L-pDC经静脉感染HSV-1（5×10）6pfu/小鼠），并每12小时监测一次存活率（**，P<0.01；***，P<0.01；ns，不显著，对数秩[Mantel–Cox]检验）。（D–F）6–8周龄WT和CXXC5−/−室友(n个=5）静脉感染VSV（5×106pfu/鼠标）。感染后6 h（D）或3 D（E）收集血清进行ELISA检测，每12 h（F）监测一次存活率。这些实验重复一次，结果相似，数据由Student’st吨测试和表示为平均值±SD（D和E）或对数库（Mantel-Cox）测试（F；*，P<0.05；**，P<0.01；ns，不显著）。
图9。
图9。
测试2−/−小鼠体内易受病毒感染。（A） 10个5从WT和Tet2中分类的脾pDC−/−用CpG-A（2µg/ml）刺激小鼠48小时，收集上清液用于ELISA(n个= 6). 该实验进行了三次，数据由Student’st吨测试和表示为平均值±SD（*，P<0.05）。UT，未经处理。（B） 8周龄体重(n个=8）和Tet2−/−(n个=14）窝友静脉感染HSV-1（5×106pfu），每12小时监测一次死亡率和发病率。本实验进行了两次，采用log-rank（Mantel-Cox）检验进行统计分析（*，P<0.05）。（C） 8周龄WT和Tet2−/−室友(n个=9）静脉感染VSV（5×106pfu），每12小时监测一次存活率和体重减轻情况。本实验进行了两次，并采用log-rank（Mantel-Cox）检验进行统计分析（数据以平均值±SD表示；*，P<0.05）。
图10。
图10。
CXXC5和Tet2调节人类pDC中IFN的产生。（A和B）HSV-1（MOI:2）或R848（1µg/ml）刺激对照组和CXXC5或Tet2-knowdown Gen2.2细胞4 h，并表达IRF7型和干扰素α/β通过实时PCR进行分析(n个= 4). 这些实验重复两次，数据显示为平均值±SD，由Student’s分析t吨测试（**，P<0.01；***，P<0.001）。UT，未经处理。（C） 根据我们在此提供的数据，我们认为CXXC5可能作为低甲基化CpG岛的表观遗传读取器，并与Tet2协同调节pDC中的基因表达。CXXC5通过影响DNA甲基化和随后的组蛋白修饰，不仅促进含有CGI的转录因子（如IRF7）的组成性表达，而且开放促炎基因启动子（如Tnfα），从而启动pDC以用于TLR7/9诱导的IFN和促炎反应。
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