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.2017年4月12日5:e3086。
doi:10.7717/peerj.3086。 2017年电子收集。

活细胞APP蛋白水解的直接成像

尼科洛·帕里尼 1 2, 安布拉·德尔·格罗索 三, 克劳迪娅·安东尼 1, 马尔科·切奇尼 三, 雷纳托·科拉迪蒂 2, 弗朗西斯科·帕沃内 1 4, 马蒂诺·卡拉梅 1 4
附属公司

活细胞APP蛋白水解的直接成像

尼科洛·帕里尼等。 同行J. .

摘要

阿尔茨海默病是一种由遗传、表观遗传和环境因素相互作用引起的多因素疾病。由A组成的细胞毒性低聚物的形成β肽被广泛认为是引发阿尔茨海默病发展的主要关键事件之一。A类β肽的产生是淀粉样前体蛋白（APP）特异性蛋白水解过程的结果。解密控制APP裂解分泌酶活性的因素仍然是一个关键问题。商用试剂盒可测量细胞裂解物分泌酶的酶活性，在体外相比之下，我们开发了一种原型快速生物测定法，可直接在活细胞中提供APP蛋白水解过程的可见信息。APP分别在C端和N端与绿色荧光蛋白的单体变体和红色荧光蛋白的单体变体（mChAPPmGFP）融合。用共焦显微镜观察转染人神经母细胞瘤和大鼠神经细胞中蛋白水解处理速率的变化，以及红/绿荧光强度比的变化。在过度表达β-分泌酶BACE1或α-与单体蓝色荧光蛋白融合的分泌酶ADAM10证实，蛋白水解位点仍然可以进入。使用特定的siRNA评估内源性BACE1的贡献。有趣的是，我们发现APP的蛋白水解过程在同一单个细胞内并不完全均匀，并且同一类型的细胞之间存在高度的变异性。我们还能够用荧光光谱仪跟踪BACE1过度表达时细胞外介质红色发射强度的变化。这是荧光显微镜的一种补充方法，用于实时快速检测APP蛋白水解过程中的变化。为了允许α-和β-分泌酶活性，我们创造了一种mChAPPmGFP的变体，其突变可以抑制α-分泌酶分裂不干扰β-分泌酶加工。此外，通过使用能够同时激发和测量红色和绿色荧光的流式细胞仪，我们获得了上述条件下红/绿比率变化的定量稳健估计。我们的新方法为适用于研究药物或特定条件的影响、以无偏见的方式研究APP在单个活细胞中的蛋白水解过程、阐明变异的原因和驱动APP处理的因素的生物测定奠定了基础。

关键词：阿达姆10；阿尔茨海默病；淀粉样前体蛋白；背景1；面部表情；荧光显微镜；成像；体内试验。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者们声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。生物测定原理的示意图。
（A） 各种嵌合结构的设计。N末端标记插入靶向质膜APP的信号肽（SP）之后。HA和AP是两个短氨基酸序列。HA被特定抗体识别，AP被特定酶生物素化。（B） 一旦mChAPPmGFP被β-分泌酶，sAPPβ携带mCherry（mCherry-sAPP）的碎片β)释放到介质中，导致红色和绿色荧光强度的比率发生变化。
图2
图2。mChAPPmGFP的正确靶向性和mCherry与mGFP共定位。
（A） 共焦的最大强度投影z（z）-转染mChAPPmGFP的固定人SH-SY5Y细胞堆，表面标记有与二级Alexa 405抗体偶联的抗mCherry（蓝色）。共焦最大强度投影z（z）-用mChAPPmGFP转染的活体人SH-SY5Y细胞（B）和大鼠海马神经元（E）堆叠。（H） 共焦的最大强度投影z（z）-用apAPPha转染并标记有链霉亲和素Alexa 568（红色）的固定和渗透SH-SY5Y细胞堆，链霉亲和物Alexa 558与生物单位化AP标签结合，抗HA与次级Alexa 488抗体偶联（绿色）。Pearson（Pc）和Manders系数（M1和M2）接近1，以及强度相关商（ICQ）证实了散射图（C、F、I）的线性相关和Li强度相关分析（D、G、J）的指数形状所显示的红色和绿色信号的高度共定位接近0.5。偶然获得观察到的Pcs的概率与Costes的随机化成反比P（P）值，在所有情况下都是100%。标尺，10µm。
图3
图3。mChAPPmGFP处理的红/绿荧光强度比和细胞间变异性。
共焦最大强度投影z（z）-用mChAPPmGFP转染的活体人SH-SY5Y细胞（A）和大鼠海马神经元（B）堆叠。在相同的细胞群中，平均红/绿荧光比率可能会波动（如彩色箭头所示）。红/绿比率图像经过平均滤波（2像素），仅用于表示目的。标尺10µm。
图4
图4。原则证明：过度表达β-分泌酶能有效切割mChAPPmGFP。
（A） 共焦的最大强度投影z（z）-与mChAPPmGFP和Bace1-mBFP共同转染的活人SH-SY5Y细胞堆。红/绿荧光比率图像经过平均滤波（2像素），仅用于表示目的。鳞片，10µm。（B） 比率图像（A）中描绘的两个细胞的不同平均红/绿荧光强度比值与Bace1-mBFP的过度表达相关（误差条，s.d.）。（C） 不同转染条件下SH-SY5Y细胞平均红/绿比率的斑点杂交。n个每种情况>15；***，第页<0.001，根据未配对学生-t吨以不相等的方差进行测试，针对仅转染mChAPPmGFP或mChAPP770mGFP的细胞进行。（D） 转染SH-SY5Y细胞裂解物（品红色）和细胞外基质（青色）的叠加Westernblot，用抗mCherry标记。反复剥离裂解物印迹，并用抗GFP、抗APP和抗A重新标记β。较低波段对应于mCherry-sAPP，而较高波段对应于全长mChAPPmGFP。（E） 用荧光分光光度计分析了SH-SY5Y细胞在不同转染条件下的细胞外培养基。在550 nm激发后收集发射光谱。
图5
图5。mChAPPmGFP在神经元中被正确处理。
共焦最大强度投影z（z）-与mChAPPmGFP和mBFP（A）或Bace1-mBFP共同转染的活大鼠海马神经元堆。红/绿比率图像经过平均滤波（2像素），仅用于表示目的。插图与比率图像中概述的放大区域相对应。标尺10µm。
图6
图6。FACS流式细胞仪作为筛选mChAPPmGFP处理的附加方法。
（A） 散点图中的每个点代表单个细胞的绿色和红色荧光强度。任意选择散点图中的两个不同区域（红色和绿色），以便这两个区域包含相同数量的与mChaPPmGFP和对照siRNA共转染的SH-SY5Y细胞。这些区域用于对与mChaPPmGFP及Bace1-mBFP、Bace1-siRNA或对照siRNA共同转染的细胞的散点图进行选通，并计算红色区域中的细胞数与绿色区域中细胞数的平均比率（B）。n个=3个独立实验；误差线，s.d。；第页<0.0001，根据未配对学生-t吨对转染mChAPPmGFP的细胞进行测试，并控制siRNA。
图7
图7。mChAPP第1页mGFP突变体不能被α-分泌酶ADAM10。
（a） 共焦最大强度投影z（z）-不同转染条件下的活人SH-SY5Y细胞堆叠。红/绿比率图像经过平均滤波（2像素），仅用于表示目的。标尺10µm。（b） 不同转染条件下SH-SY5Y细胞平均红/绿比率的斑点杂交。n个每种情况>10；***，第页<0.001，根据未配对的学生-t吨用不等方差检验。（C） 流式细胞术证实P1突变对α-分泌酶，但不是β-分泌酶，加工。n个=3个独立实验；误差线，s.d.；*，第页 < 0.05, ***,第页<0.001，根据未配对学生-t吨用不等方差检验。图S7显示了一个实验的散点图。
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