A single biochemical activity underlies the pleiotropy of the aging-related protein CLK-1

doi:10.1038/s41598-017-00754-z

.2017年4月12日；7(1):859.

doi:10.1038/s41598-017-00754-z。

单一的生化活性是老化相关蛋白CLK-1多效性的基础

刘菊玲¹, 卡利斯塔·耶伊¹, 王颖（音）¹, 齐格弗里德·赫基米²

附属公司

PMID： 28404998
预防性维修识别码： PMC5429816
内政部： 10.1038/s41598-017-00754-z

单一的生化活性是老化相关蛋白CLK-1多效性的基础

刘菊玲等。科学代表. 2017.

.2017年4月12日；7(1):859.

doi:10.1038/s41598-017-00754-z。

作者

刘菊玲¹, 卡利斯塔·耶伊¹, 王颖（音）¹, 齐格弗里德·赫基米²

附属公司

¹加拿大蒙特利尔麦吉尔大学生物系，H3A 1B1。
²加拿大蒙特利尔麦吉尔大学生物系，H3A 1B1。Siegfried.Hekimi@McGill.ca。

PMID： 28404998
预防性维修识别码： PMC5429816
内政部： 10.1038/s41598-017-00754-z

摘要

秀丽隐杆线虫clk-1基因和同源小鼠基因Mclk1编码一种线粒体羟化酶，是泛醌（UQ）生物合成所必需的。这些基因的突变在这两个物种中产生广泛的多效性表型，包括延长动物寿命。秀丽线虫clk-1突变体的一些特征，包括母体效应，特别是广泛的多效性，以及等位基因之间无法解释的差异，都表明clk-1/MCLK1除了在UQ生物合成中的功能外，还可能具有其他功能。此外，最近的一项研究表明，一个隐秘的核定位信号可能导致在培养的哺乳动物细胞系中进行核定位。在这里，通过在蠕虫中使用免疫组织化学技术和在哺乳动物细胞中使用纯化技术，我们未能检测到MCLK1或CLK-1蛋白的任何核富集以及缺乏线粒体定位序列的秀丽线虫CLK-1蛋白质的任何生物活性。此外，最重要的是，通过药物恢复clk-1无效突变体中的UQ生物合成，我们表明UQ生物生成的缺失是clk-1缺失导致的所有表型的原因，包括行为表型、线粒体质量控制基因表达的改变和寿命。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
2,4-二羟基苯甲酸（DHB）是UQ生物合成的非自然旁路前体。UQ由连接到聚异戊二烯侧链的苯醌环组成。侧链的长度因物种而异。它是长约9个类异戊二烯亚基C类.挽歌（UQ）₉). 所有细胞都依赖内源性生物合成来提供UQ。酶编码*第1类*及其同源词(*合同条款7*在酵母中，*麦克lk1*在小鼠中，以及*COQ7公司*在人类中）催化UQ生物合成的倒数第二步，即位置6处DMQ的羟基化。在真核生物中，苯醌环的天然生物合成前体是4-羟基苯甲酸盐（4-HB），但2,4-二羟基苯甲酸酯（DHB）是4-HB的羟基化类似物，能够作为UQ合成的替代前体，尽管是非自然的，它允许在没有CLK-1/COQ7/MCLK1步骤的情况下合成UQ^,.

图2
补充2,4-DHB可恢复UQ的生物合成*第1类*突变体。具有指定基因型的蠕虫醌提取物的HPLC-UV色谱图。DMQ的洗脱时间₉和UQ₉显示。在第一幼虫期，将蠕虫转移到添加或不添加DHB的平板上。它们被喂食UQ缺陷菌株GD1，并在收获进行醌提取之前生长到成年阶段。含250的全蠕虫匀浆除*第1类*(*qm30个*)暴露于0.5 DHB的突变体 mM在含有440的匀浆的平板中 μg蛋白质用于HPLC分析。DHB处理恢复了UQ的生物合成*第1类*(*qm30个*)突变体呈剂量依赖性，但对野生型（N2）无显著影响。

图3
的行为缺陷*第1类*(*qm30个*)突变体被2,4-DHB完全拯救。(一)*第1类*突变体的抽吸速度明显慢于野生型。1 mM 2,4-DHB完全缓解了*第1类*在这个浓度下，2,4-DHB对野生型没有影响。条形图表示每分钟泵的平均数量。(b条)*第1类*突变体的排便周期长度显著延长。1 mM 2,4-DHB可完全缓解慢性排便症状*第1类*.2,4-DHB对野生型无影响。条形图表示动物的平均排便周期，在未经治疗的情况下，每个连续三个排便周期都进行了评分*第1类*(*qm30个*)突变体和所有其他条件下连续五个排便周期。误差条代表S.E.M.（n ≥ 每种情况下20只动物）。星号表示数据与野生型数据有显著差异。所有差异在p < 经t检验为0.0001。

图4
The longevity of第1类突变体被2,4-DHB拯救。(一)补充0.15 mM和1 mM 2,4-DHB完全挽救了*第1类*突变体。(b条)补充0.15 mM或1 mM 2,4-DHB对野生型寿命没有影响。(**c（c）**)用1治疗 mM 3,4-DHB不会影响其中任何一种的寿命*第1类*突变体或野生型。(d日)用1治疗 mM 2,4-DHB可延长*第1类*(*e2519号*)突变体，对野生型寿命没有影响。所有寿命试验的样本量、数值和统计分析见表S2。

图5
*时钟-1*(*ΔMTS*)::*GFP公司*无法拯救的表型*第1类*突变体(一)*第1类*(*qm30个*)突变体在喂食OP50时生长缓慢，在喂食UQ时停止生长₈-缺陷细菌GD1。两种表型都是通过全长CLK-1:：GFP的单拷贝插入来挽救的。两种表型均未通过单拷贝插入*时钟-1*(*ΔMTS*)时间：*GFP公司*，缺乏线粒体靶向序列*第1类*.（n） ≥ 每个基因型30只动物）。(b条)泵送速度慢，排便速度慢*第1类*(*qm30个*)通过全长CLK-1：：GFP的表达可以完全拯救突变体，但不能通过CLK-1（ΔMTS）：：GFP的表达。条形代表每分钟泵的平均数量或动物的平均排便周期，在以下情况下，每个连续三个排便周期都进行了评分*第1类*(*qm30个*)所有其他基因型的突变株和连续五个排便周期。误差条代表S.E.M.（n ≥ 每个基因型20只动物）。星号表示数据与野生型数据有显著差异。所有差异在p < 经t检验为0.0001。(**c（c）**), (d日)和(如果)CLK-1（ΔMTS）：：GFP的表达对*第1类*(*qm30个*),*第1类*(*qm30个*);*daf-2型*(*e1370（电子1370）*)或*第1类*(*e2519号*)突变体。(**e（电子）**)用1治疗 mM 2,4-DHB可延长*第1类*(*qm30个*);*时钟-1*(*ΔMTS*)::*GFP公司*对野生型的寿命没有影响。所有寿命试验的数值和统计分析见表S2。

图6
中基因表达的变化*第1类*通过表达CLK-1:：GFP或通过2,4-DHB治疗可以挽救突变株。(一,b条)UPR的mRNA水平^公吨用实时定量PCR检测第1天成虫的基因。结果被归一化为野生型的mRNA水平。*第1类*(*qm30个*)蠕虫表现出不同的表达*热休克蛋白-60*和*热休克蛋白-6*CLK-1:：GFP的表达，而不是CLK-1（ΔMTS）：：GFP，挽救了*热休克蛋白-60*和*热休克蛋白-6*在里面*第1类*突变体。通过治疗可以达到同样的抢救效果*第1类*带有2,4-DHB的突变体。(**c（c）**)*spg-7型*mRNA水平与我们检测的所有基因型相同。(d日,**e（电子）**)GFP强度的量化*Phsp-6型*::*GFP公司*值表示为GFP荧光强度相对于*Phsp-6型*::*GFP公司*野生型背景的记者。2,4-DHB治疗降低了报告基因的表达*第1类*突变体，而它对对照菌株的影响很小。误差条指示S.E.M.（n ≥ 30只动物）*第页 < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001. 比例尺：100 微米。

图7
检测蛋白质组分中的MCLK1。小鼠胚胎成纤维细胞核蛋白提取物的Western blot分析(一)小鼠组织核蛋白组分的Western blot分析(b条).麦克lk1KO细胞是按照之前发表的方法生成的，KO组织样本是从以前获得的*麦克lk1*参考文献中描述的KO小鼠。他们被用来进一步确认乐队的身份。野生型对照为*麦克lk1*没有Cre表达的漂浮MEF或组织。在两个面板中，40 除膜组分（MF）外，每条通道的蛋白质含量为µg，其中5 使用µg。HDAC1被用作核可溶性部分（NF）的负荷控制。对于不溶性（染色质结合）核组分（CBF），层粘连蛋白A/C和组蛋白H3作为标记物。线粒体基质蛋白SOD2被用作额外的对照，以验证核蛋白组分的纯度。(一)在MEF中，MCLK1只能在膜组分（MF）中检测到。(b条)在小鼠组织中，核可溶性组分（NF）和膜组分（MF）中均检测到MCKL1。然而，线粒体基质蛋白SOD2也可在两个组分中检测到，这表明核可溶部分被线粒体污染。MCLK1在染色质结合核组分（CBF）中未检测到。因此，没有证据表明细胞核中存在MCLK1或与染色质相关。补充数据中显示了带有尺寸指示的未截取的western blot扫描。

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