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.2017年6月1日；28(11):1489-1506.
doi:10.1091/mbc。E17-03-0195。 Epub 2017年4月12日。

人腺嘌呤核苷酸转位酶与呼吸小体在物理和功能上相互作用

亚文路 1, 米歇尔·格雷斯·阿科巴 1, 坎达萨米·塞尔瓦拉朱 1, 黄泰昌 2 三, Raja S Nirujogi国王 2, 加亚南·萨特 2, 阿克希利什·潘迪 2, 史蒂芬·M·克莱普 4
附属公司

人类腺嘌呤核苷酸转移酶在物理和功能上与呼吸小体相互作用

亚文路等。 分子生物学细胞. .

摘要

腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）家族成员通过线粒体内膜将ADP交换为ATP，这是氧化磷酸化（OXPHOS）所必需的活动。ANT的突变或失调与进行性眼外肌麻痹、心肌病、非综合征性智力残疾、细胞凋亡和Warburg效应有关。尚未系统地确定人类ANT的结合伙伴。缺乏此类信息妨碍了对各种ANT相关疾病的详细分子理解，包括对其不同表型表现的深入了解。为了填补这一空白，在本研究中，我们定义了两种人类ANT亚型的相互作用体。与酵母类似，人类ANT与异源伙伴蛋白相关，包括呼吸超复合体（RSC）和其他溶质载体。进化上保守的ANT-RSC关联尤其值得注意，因为酵母和人类中RSC的组成和组织是不同的。令人惊讶的是，主要ANT亚型的缺失仅适度损害HEK293细胞中的OXPHOS，这表明低水平的其他亚型提供了功能冗余。相反，对OXPHOS表达和功能的药理学抑制抑制了ANT依赖性ADP/ATP交换。因此，ANT和OXPHOS机械在物理上相互作用，在功能上相互合作，以增强ANT运输能力和线粒体呼吸。

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图1：
图1：
同种异型特异性抗体能够区分高度同源的ANT蛋白。（A） 人类腺嘌呤核苷酸转位酶高度保守，与Aac2p有显著相似性，Aac2p是酿酒酵母.以红色和绿色突出显示的是分别由ANT1（小鼠单克隆抗体）和ANT2/ANT3单克隆抗体识别的表位；跨膜螺旋呈黄色。（B） 使用肽阵列（顶部）对新生成的ANT1特异性单克隆抗体识别的表位进行定位，发现其为RTRLAADVGKGAAQR。在以牛ANT1（蛋白质数据库1OKC）为模板构建的人类ANT1的结构中，表位也以红色突出显示。肽阵列（底部）也用于确定相应兔多克隆ANT1识别的表位。（C） 酵母提取物（左）源自Δaac2型通过SDS-PAGE解析异源表达的yhANTs或空载体，并用ANT1特异性单克隆抗体或ANT2/ANT3单克隆抗体进行免疫印迹，以测试亚型特异性。Tom70p是一种外线粒体膜蛋白，起着负荷控制作用。来自小鼠肝脏、心脏和骨骼肌（右侧）的线粒体（50μg）同样被分离，以测试兔ANT1抗血清的特异性。
图2：
图2：
ANT以高分子量复合物组装。从表达内源性ANT2/3（A）或过度表达（B，C）的HEK293 Flp-In细胞（wt）分离的线粒体（200μg），指示的ANT构建物或从指示的小鼠组织分离的线粒体用洋地黄苷溶解，通过2D BN/SDS-PAGE解析，并使用（A，B）ANT2/ANT3，（C）ANT1或（B）FLAG抗体进行ANT的免疫印迹。UQCRC2、NDUFB6和COX4显示ANT与RSC的兼容。在B中，CNAP-ANT2和内源性ANT2/3过度表达。
图3：
图3：
HEK293 Flp-in细胞中过度表达的ANT1和ANT2与许多异源蛋白相互作用，包括呼吸亚单位和其他溶质载体。（A） 定义ANT交互组的实验工作流。在低强度IP下与过度表达的CNAP-ANT1（B）或CNAP-AAN2（C）相互作用的蛋白质散点图。位于红色虚线上方的已确定点击是重/轻同位素比率>0的富集蛋白质。（D） 维恩图显示了被鉴定的蛋白质数量（重/轻同位素比值>0），这些蛋白质是低强度和高强度IP共享的或唯一的。（E） 将CNAP-ANT2（标记）与CNAP-ANT 1（未标记）进行查询时识别的蛋白质的散点图。插入，使用FLAG抗体相对表达CNAP-ANT1和CNAP-AAN2。
图4：
图4：
生成蚂蚁2-使用TALEN介导的基因破坏的零细胞模型。（A） 293 Flp-in（wt）ANT亚型的相对mRNA水平。通过比较分析数据C类T型(ΔΔC类T型)方法，表示为平均折叠变化（2-ΔΔ计算机断层扫描)±扫描电镜(n个=4）相对于ANT2型表达式，设置为1。（B） 基于质谱的重量线粒体ANT亚型相对蛋白质丰度定量10无标签量化（LFQ）信号强度。未检测到ANT4。n个= 3. （C） 人才介导的ANT2型wt细胞中的核苷酸缺失改变了起始位点，导致所有四种细胞中ANT2翻译提前终止蚂蚁2人才克隆。（D） 从wt和蚂蚁2人才用ANT2/ANT3-和ANT1特异性抗体进行免疫印迹的克隆。（E） D.细胞提取物中ANT2/ANT3表达的密度分析。相对于wt±SEM的表达(n个≥ 4). （F） 相对mRNA水平ANT2型在里面蚂蚁2人才通过ΔΔ分析的克隆C类T型方法，表示为与wt±SEM相比的平均倍数变化(n个= 4). （G） 相对信使核糖核酸水平ANT1型,ANT3公司，或ANT4公司在里面蚂蚁2人才用ΔΔ分析克隆C类T型方法，表示为与wt±SEM相比的平均折叠变化(n个≥ 4).
图5：
图5：
蚂蚁2人才细胞减少了ADP/ATP转运，但保留了RSC亚单位的表达和组装。（A） 对所示菌株的线粒体（50μg）进行免疫印迹，如下所示。（B） A.线粒体提取物中蛋白质稳态水平的密度分析。相对于wt±SEM的表达(n个≥ 4). （C） 来自空载体的线粒体（250μg）-转染wt或蚂蚁2人才用1.25%（wt/vol）洋地黄素溶解细胞，通过2D BN/SDS-PAGE进行解析，并对ANT2/ANT3、NDUFB6（复合物I）和COX4（复合物IV）、SDHA（复合物II）、UQCRC2（复合物III）或TIM23（负载控制）进行免疫印迹。n个= 3. （D） 线粒体（100μg）来自wt和蚂蚁2人才细胞与脂质体融合，脂质体内预载5 mM未标记ADP。对[14C] ADP（nM/mg蛋白质/min±SEM；n个=3）在有或无40μM CATR的情况下进行随访。（E） 在没有抑制剂的情况下，通过从ADP/ATP转运中减去CATR敏感交换，从D计算ANT特异性活性，并以重量百分比（100%）表示。（F） 存在或不存在10μM CATR时内源性ANT2与COX4的CoIP。B、 绑定；PC，预滤。
图6：
图6：
蚂蚁2人才细胞改变了生物能量学参数，减少了呼吸，增加了对ANT抑制剂的敏感性。（A） OCR（pmol O2/最小±扫描电镜；n个≥40）在指定条件下，使用Seahorse XF96e通量分析仪和Mito应力测试套件进行测量。（B） 在葡萄糖刺激下或FCCP处理解偶联线粒体后获得基础OCR和最大OCR。ATP生成量表示为基础OCR减去寡霉素后耗氧量。质子泄漏OCR详细记录了寡霉素治疗后线粒体消耗的氧气。在葡萄糖刺激下或FCCP治疗解偶联线粒体后获得的耦合度（百分比）和剩余呼吸容量（重量百分比）。数据表示平均值±SEM。n个≥ 79. （C） 基本和最大OCR、ATP生成、质子泄漏OCR、耦合度、wt和备用呼吸容量蚂蚁2人才细胞与指示浓度的BKA孵育过夜。数据表示平均值±SEM。n个≥ 79.
图7：
图7：
ANTs在蚂蚁2人才细胞拯救ADP/ATP交换并提高生物能量效率。（A） ANT过表达者中ANTs的相对mRNA水平及相关wt和蚂蚁2塔伦矢量控制。数据通过ΔΔ进行分析C类T型方法，表示为平均折叠变化（2-ΔΔ计算机断层扫描)±扫描电镜(n个≥3）相对于用空载体转染的wt中ANT表达，设置为1。（B） wt全细胞提取物（50μg），蚂蚁2人才,和蚂蚁2人才用ANT1和ANT2/ANT3特异性抗体免疫印迹过表达各种ANT亚型的克隆。GRP75和β-肌动蛋白作为负载对照。（C） B细胞提取物中ANT2/ANT3（左）或ANT1（右）表达的密度分析。相对于wt±SEM的表达(n个≥ 7). （D） 线粒体（100μg）来自体重，蚂蚁2人才,和蚂蚁2人才将过表达各种ANT亚型的克隆与预载5 mM未标记ADP的脂质体融合。吸纳[14C] ADP（nM/mg蛋白质/min±SEM；n个=6）有无60μM CATR。（E） 在不含抑制剂的情况下，通过从ADP/ATP转运中减去CATR敏感交换，从D计算ANT特异性活性，并表示为wt（100%）±SEM的平均百分比(n个≥ 3). （F） OCR和（G）计算的基础最大质子泄漏OCR（pmol O2/最小±扫描电镜；n个≥21），耦合度，备用呼吸容量（wt+v的百分比），以及蚂蚁2人才过度表达ANT1、ANT2或ANT3的细胞（±SEM；n个≥ 21). 注意，从矢量转染的wt和蚂蚁2人才细胞与图6C中0μM BKA处理下的细胞相同。（H） 用指示浓度的BKA（μM）孵育过夜后获得的基本、最大和质子泄漏OCR，以及ATP产生、偶联度和备用呼吸能力。
图8：
图8：
ANT过度表达于蚂蚁2人才细胞不会改变RSC亚单位的表达、组装或活性。（A） 对所示菌株的SDS-PAGE溶解线粒体（50μg）进行免疫印迹，如下所示。（B） A.线粒体提取物蛋白质稳态水平的密度分析。表达与wt±SEM的关系(n个= 3). （C）蚂蚁2人才表达各种ANT亚型的线粒体（250μg）用1.25%（wt/vol）的洋地黄苷溶解，通过2D BN/SDS–PAGE进行解析，并对ANT2/ANT3、ANT1、NDUFB6（复合物I）和COX4（复合物IV）、SDHA（复合物II）、UQCRC2（复合物III）和TIM23进行免疫印迹。n个= 3. （D） NADH脱氢酶（活性/μg/min±SEM；n个=6，（E）细胞色素c还原酶（μmol细胞色素c减少/min/mg±SEM）；n个=8）和（F）细胞色素c氧化酶（活性/μg/min±SEM；n个≥3）溶解DDM的线粒体提取物的活性。（G） 从空载体转染的wt细胞或蚂蚁2人才如图所示，转染细胞用1.25%（wt/vol）洋地黄素溶解，通过3-10%（复合物I和IV）或6-16%（考马斯和复合物V）一维BN-PAGE溶解，并与复合物I、IV或V底物孵育。凝胶考马斯染色作为负荷控制。
图9：
图9：
在没有OXPHOS组件和功能的情况下，降低通电ANT传输。（A） 用15μg/ml Dox处理7天的wt细胞或用新鲜培养基追踪3或20天的细胞的线粒体（50μg）进行免疫印迹，如表所示。（B） A.蛋白质稳态水平的密度分析相对于未处理的wt（半乳糖）±SEM的表达(n个≥6）。（C） NADH脱氢酶（活性/μg/min±SEM；n个≥4），（D）细胞色素c还原酶（μmol细胞色素c减少/min/mg±SEM）；n个=4），和（E）细胞色素c氧化酶（活性/μg/min±SEM；n个≥4）溶解DDM的线粒体提取物的活性。（F） 用15μg/ml Dox处理7天的wt细胞或用新鲜培养基追踪3或20天的细胞的线粒体（200μg）用1.25%（wt/vol）洋地黄蛋白溶解，用2D BN/SDS-PAGE进行解析，并对ANT和指示的呼吸复合物进行免疫印迹。（G） 未经处理并生长在葡萄糖（Glu）中的wt细胞的线粒体（100μG），用15μG/ml Dox处理7天，或用新鲜培养基追踪3或20天的细胞的线粒体，与预先加载5 mM未标记ADP的脂质体融合。吸纳[14C] ADP（nM/mg蛋白质/min±SEM；n个= 3). （H） 对[14C] ADP（nM/mg蛋白质/min±SEM；n个在5 mM谷氨酸和苹果酸存在的情况下，测定=6）进入带电线粒体（500μg）。
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    1. Aprille JR，Austin J.线粒体腺嘌呤核苷酸库大小的调节。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1981;212:689–699.-公共医学
    1. Baile MG、Sathapa M、Lu YW、Pryce E、Whited K、McCaffery JM、Han X、Alder NN、Claypool SM。未建模和重塑的心磷脂在酵母中的功能无法区分。生物化学杂志。2014;289:1768–1778.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bauer MK、Schubert A、Rocks O、Grimm S.腺嘌呤核苷酸转座子酶-1是通透性转换孔的一种组分，能显著诱导细胞凋亡。细胞生物学杂志。1999;147:1493–1502.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 品牌MD、Pakay JL、Ocloo A、Kokoszka J、Wallace DC、Brookes PS、Cornwall EJ。线粒体的基础质子电导取决于腺嘌呤核苷酸转位酶的含量。《生物化学杂志》2005；392:353–362.-项目管理咨询公司-公共医学

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