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.2017年4月11日；19(2):255-266.
doi:10.1016/j.celrep.2017.03.041。

FAD调节小鼠隐色素蛋白稳定性和昼夜节律时钟

阿里莎·平野 1, 丹尼尔·布拉斯 2, 英辉福 三, 路易斯·帕塔切克 4
附属公司

FAD调节小鼠隐色素蛋白稳定性和昼夜节律时钟

阿里莎·平野等。 单元格代表. .

摘要

生物钟产生新陈代谢和生理过程的生物节律，包括睡-睡循环。我们之前在CRYPTOCHROME2（CRY2）的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合口袋中发现了一个错义突变，CRY2是一种导致人类晚期睡眠期的时钟蛋白。这促使我们研究FAD作为时钟和新陈代谢介质的作用。FAD稳定了CRY蛋白，导致蛋白质水平增加。相反，FAD生物合成酶核黄素激酶（Rfk）的敲除增强了CRY的降解。RFK蛋白水平和FAD浓度在细胞核内振荡，表明它们受昼夜节律控制。敲除Rfk结合缺乏核黄素的饮食改变了小鼠肝脏中的CRY水平以及时钟和时钟控制基因的表达谱（尤其是与代谢相关的基因，包括葡萄糖稳态）。我们得出结论，FAD的光非依赖性机制调节CRY，并有助于哺乳动物代谢基因的正常昼夜振荡。

关键词：CRY；密码色素；时尚；FBXL3；核黄素激酶；昼夜节律钟；昼夜节律；代谢；蛋白质降解。

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数字

图1
图1。FAD稳定CRY蛋白
（A） FAD对HEK293总细胞裂解物中CRY1和CRY2蛋白水平的影响。转染后42小时，用100μM FAD处理HEK293细胞6小时。数据显示为SEM平均值（n=3，*：p<0.05）t吨-测试）。（B） NIH3T3细胞内源性CRY1和CRY2蛋白的降解试验。用100μM FAD（或PBS作为对照）预处理细胞6小时，然后用100μg/ml CHX和/或100μM FAD处理细胞。对细胞进行分馏，并使用核提取物进行蛋白质印迹分析。起始点（t=0小时）的CRY蛋白水平标准化为1。数据显示为SEM平均值。（C）HEK293细胞中WT-CRY2和A260T-CRY2蛋白的降解试验。转染后42小时，用FAD预处理HEK293细胞6小时，然后用100μg/ml CHX和/或100μM FAD处理。细胞被分离。t=0小时时核部分的CRY蛋白水平标准化为1。数据显示为SEM平均值（n=3）。通过双向方差分析确定显著性（p<0.05）。（D） CRY和RFK在转染NIH3T3细胞中的表达卢比siRNA。通过western blotting分析过表达的FLAG-CRY2、内源性CRY1和RFK蛋白水平（n=3，*：通过Dunnett检验p<0.05）。（E） 稳定表达NIH3T3细胞中CRY1和CRY2的表达Rfk公司shRNAs（n=3，*：经Dunnett检验p<0.05）。（F） CRY1在转染NIH3T3细胞中的表达Flad1（Flad1）siRNAs（n=3，*：p<0.05，按学生t吨-测试）。（G） 中CRY1和CRY2蛋白的降解测定卢比击倒细胞。转染NIH3T3细胞卢比siRNA和CRY表达载体。转染后42小时，用100μg/ml CHX处理细胞。通过双向方差分析和事后检验确定统计显著性（*：p<0.05）。（H） 稳定表达NIH3T3细胞内源性CRY1和CRY2蛋白的降解分析卢比shRNA。通过双向方差分析和事后检验确定统计显著性（*：p<0.05）。（I） FBXL3竞争分析。使用HA或FLAG抗体纯化HEK293细胞中表达的FLAG-CRY1-HA-FBXL3或Myc-CRY2-FLAG-FBXL3复合物。将FAD添加到CRY-FBXL3复合物中，并在4°C下培养2小时在体外.
图2
图2。FAD合成途径成分的节律性表达
（A） 的时间表达模式每个1（阳性对照），卢比、和Flad1（Flad1）在小鼠肝脏中。每6小时处死一次吸入LD 12:12的C57BL/6J小鼠。mRNA水平标准化为G3pdh公司（B）在DD中，RFK在小鼠肝脏中的时间表达谱。对于DD，在DD的第二天每4小时处死一次小鼠。肝脏被分为细胞核和细胞溶质部分。数据显示为平均值±SEM（n=3）。通过单因素方差分析确定统计显著性（p<0.05）。（C） 小鼠肝细胞核中的相对FAD量。数据显示为平均值±SEM（n=3）。
图3
图3。FAD治疗的PER2:：LUC MEF的细胞节律
（A） MEF中PER2:：LUC生物发光的代表性节律每2个吕克敲小鼠。用100 nM DEX同步MEF的细胞节律。用含有10–100μM FAD（或PBS）和100μM荧光素的记录介质代替介质，用于记录生物发光。生物发光节律的周期长度显示为平均值±SEM（根据Tukey的测试，n=4，*：p<0.05）。（B） 用100 nM DEX使NIH3T3细胞同步化。用含有100μM FAD（或PBS）的新鲜培养基代替培养基。总细胞裂解物用于western印迹分析。数据显示为平均值±SEM（n=3，*：通过双向方差分析和事后检验，p<0.05）。
图4
图4。的影响Rfk公司小鼠肝脏时钟蛋白的敲除
（A） 的实验方案体内击倒卢比基因。给小鼠喂食正常或核黄素缺乏的食物2周。卢比在ZT10-12通过尾静脉将siRNA或对照siRNA注射到小鼠体内。注射后3天或6天，处死小鼠收集肝组织。（B） ZT18时CRY1、CRY2和RFK的核蛋白水平。TATA-结合蛋白（TBP）作为核标记物。（C，D）DD中指定CT的PER1、CLOCK、CRY1、CRY2核蛋白水平。数据显示为平均值±SEM（n=3，*：通过双向方差分析和事后检验，p<0.05）。（E） DD中特定CT下小鼠肝脏指示时钟基因的mRNA水平。mRNA水平标准化为G3pdh公司数据显示为平均值±SEM（n=3，*：通过双向方差分析和事后检验，p<0.05）。
图5
图5。卢比敲低导致代谢途径中基因表达的改变
（A） mRNA水平G6个和包装在小鼠肝脏中。mRNA水平标准化为Tbp。数据显示为平均值±SEM（n=3，*：通过双向方差分析，p<0.05）。（B） CT12时血清（左）和肝脏（右）中的葡萄糖水平。数据显示为平均值±SEM（n=3，*：p<0.05）t吨-试验）（C）HepG2细胞耗氧率测定。用siRNA转染细胞卢比或用100μM FAD处理24小时。数据显示为平均值±SEM（n=6）。通过双向方差分析确定统计显著性。（D） HepG2细胞的细胞外酸化速率测定。细胞被转染卢比siRNA或用100μM FAD处理24小时，然后记录糖酵解探针的荧光。数据显示为平均值±SEM（对于FAD处理，n=5，对于卢比击倒）。通过双向方差分析确定统计显著性。（E） 转染Rfk和/或siRNA的HepG2细胞耗氧率测定货币1/2数据显示为转染siRNA的HepG2细胞的平均值±SEM（n=9）（F）细胞外酸化率测定卢比和/或货币1/2数据显示为小鼠肝脏中指示代谢相关基因的平均值±SEM（n=9）（G）mRNA水平。mRNA水平标准化为Tbp。数据显示为平均值±SEM（n=3，*：通过双向方差分析，p<0.05）。（H） FAD提出的CRY监管模型。经典时钟产生基因表达节奏，包括卢比和纳姆普，有节奏地合成FAD和NAD+.FAD与CRY结合可防止FBXL3介导的CRY降解，从而实现稳定。时间依赖性FAD合成调节CRY表达节律和振幅，从而调节代谢重要基因的基因表达节律。
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中的注释

  • 没有FAD，没有CRY：氧化还原和昼夜节律。
    Pritchett D，Reddy AB公司。 Pritchett D等人。 生物化学科学趋势。2017年7月；42(7):497-499. doi:10.1016/j.tibs.2017.05.007。Epub 2017年6月4日。 生物化学科学趋势。2017 PMID：28592378

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