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.2017年3月1日；7(3):518-530.
2017年电子收集。

自噬抑制抗癌药物吗啡肽诱导的细胞死亡

Sang Woo Cho先生 1, Wooju Na公司 1, 崔明治（Minji Choi） 2, 申正康（Shin Jung Kang） 三, Seok-Geun Lee先生 4, Cheol Yong Choi先生 1
附属公司

自噬抑制抗癌药物吗啡肽诱导的细胞死亡

Sang Woo Cho先生等。 美国癌症研究杂志. .

摘要

自噬是一种细胞过程，受损的细胞器和功能失调的蛋白质被降解。Morusin是一种从山茱萸根皮中分离出来的抗癌药物桑椹Morusin通过降低STAT3活性诱导人前列腺癌细胞凋亡。在这项研究中，我们检测了莫鲁辛是否诱导自噬，并检测了自噬对莫鲁辛诱导的细胞凋亡的影响。桑色素诱导HeLa细胞中LC3-II的积累和ULK1的激活。此外，我们发现在吗啡素诱导的自噬过程中，ULK1 Ser317磷酸化的诱导和ULK1 Ser757磷酸化水平的降低同时发生。莫鲁辛通过激活AMPK和抑制mTOR活性诱导自噬。接下来，我们研究了自噬在吗啡素诱导的细胞凋亡中的作用。通过用3-甲基腺嘌呤（3-MA）自噬抑制剂处理细胞来抑制自噬，可诱导高水平的桑色素介导的细胞凋亡，而单独用桑色素处理细胞可诱导中等水平的细胞凋亡。当细胞被morusin和3-MA处理时，细胞存活率大大降低。综上所述，morusin-诱导自噬，这是morusin-induced apoptosis的障碍，表明将morusin/自噬抑制剂联合治疗将提高morusin--作为抗癌药物的疗效。

关键词：AMP活化蛋白激酶；Morusin；抗癌药物；细胞凋亡；自噬。

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数字

图1
图1
Morusin诱导自噬。A.Morusin以剂量依赖性方式诱导LC3-II积累。用越来越多的莫鲁辛处理各种癌细胞，并在治疗6小时后分析LC3-II和p62水平。B.Morusin诱导LC3点堆积。用DMSO或morusin（30 uM）处理各种癌细胞，并使用抗LC3抗体通过免疫染色检测内源性LC3点。C.在三个不同的任意区域中计算LC3点的数量，如图所示。数据以平均值±SEM.D表示。自噬抑制剂3-MA抑制由桑色素诱导的LC3-II积累。用二甲基亚砜（DMSO）或桑色素（morusin）联合或不联合3-MA处理HeLa细胞，并通过免疫印迹法检测LC3和p62的水平。E.通过3-MA治疗抑制桑色素诱导的LC3点。表达GFP-LC3的HeLa细胞在存在或不存在3-MA.F的情况下，用DMSO或morusin处理指定时间。LC3点状细胞的数量在三个不同的任意区域进行计数，如图所示。数据表示为平均值±SEM。
图2
图2
Morusin在早期阶段诱导自噬。A.Morusin在起始阶段诱导自噬。表达GFP-RFP-LC3的HeLa细胞单独或联合3-MA或氯喹（CQ）处理。用共焦荧光显微镜分别在488nm和543nm的激发波长下获得含有绿色和红色荧光的LC3点的图像。在放大的图像中，箭头表示具有弱绿色荧光的红色LC3点状，箭头表示红色和绿色点状共定位。B.在三个不同的任意区域中计算LC3点的数量，如图所示。数据以平均值±SEM表示。Morusin和CQ可额外诱导LC3-II积累（左侧面板）。显示黄色和红色斑点的相对比例（右侧面板）。C.将用莫鲁辛和CQ处理的细胞中LC3-II的水平与单独用这两种药物处理的细胞的水平进行比较。
图3
图3
ULK1在莫鲁辛治疗后激活。A.穆鲁辛治疗引起的ULK1激活。用二甲基亚砜或莫鲁辛处理的HeLa细胞用所示抗体进行免疫印迹。B.ULK1激活的时间进程。在给药morusin（30 uM）后的指定时间点收集HeLa细胞，并用抗ULK1和抗LC3-II抗体进行免疫印迹。C.ULK1缺失会损害桑色素诱导的LC3-II积累。用莫鲁辛处理ULK1缺失或未缺失的HeLa细胞，并用抗LC3和抗ULK1抗体进行免疫印迹。D.ULK1缺失损害了桑色素诱导的LC3点状堆积。用莫鲁辛处理ULK1缺失或未缺失的HeLa细胞，并用抗LC3抗体进行免疫染色。E.野生型MEF或乌尔克1-用越来越多的桑色素处理KO MEF，并在桑色素处理6小时后收集细胞进行免疫印迹。F.野生型MEF或乌尔克1-用桑色素（30 uM）处理KO MEF，并在指定的时间点收集细胞进行免疫印迹。G.ULK1基因敲除可损害吗啡素诱导的LC3点积聚。野生型MEF或乌尔克1-KO MEF用莫鲁辛治疗，并用抗LC3抗体进行免疫染色。
图4
图4
Morusin激活AMPK并抑制mTOR活性。A.莫鲁辛激活ULK1和抑制mTOR。用二甲基亚砜或莫鲁辛处理HeLa细胞，并用抗ULK1、抗LC3和抗磷酸S6K抗体进行免疫印迹。莫鲁辛以时间和剂量依赖性方式激活B和C。用二甲基亚砜或莫鲁辛处理B.HeLa细胞，并在指定的时间点收集细胞，用指定的抗体进行免疫印迹。用二甲基亚砜或增加剂量的莫鲁辛处理C.HeLa细胞，并在处理6小时后收集细胞，用所示抗体进行免疫印迹。D.化合物C处理后抑制丝氨酸555诱导的ULK1磷酸化。将用桑色素和化合物C处理的细胞中Ser555和Ser757的ULK1磷酸化水平与单独用这两种药物处理的细胞的水平进行比较。E.莫鲁辛对mTOR活性的抑制作用。用莫鲁辛或雷帕霉素处理HeLa细胞，并用所示抗体对收集的细胞进行免疫印迹。
图5
图5
桑色素诱导的自噬通过抑制细胞死亡提高细胞存活率。（A） 莫鲁辛诱导自噬和凋亡的时间进程。用morusin（30 uM）处理HeLa细胞，并在指定的时间点收集细胞进行免疫印迹。（B和C）在无自噬的情况下诱导吗啡素介导的凋亡。用桑红素（30uM）处理HeLa细胞，并在指示的时间点收集细胞，用于在存在或不存在3-MA（B）或CQ（C）的情况下进行免疫印迹。（D） 利用荧光激活细胞分选（FACS）分析桑色素诱导的细胞凋亡。HeLa细胞单独或与3-MA联合处理，通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色后的FACS分析评估凋亡细胞。凋亡细胞（PI和膜联蛋白V双阳性）如图所示。（E） 桑椹素和3-MA联合治疗对STAT3信号的抑制。将桑椹碱和3-MA治疗的细胞中Tyr705处的STAT3磷酸化水平和Thr172处的AMPKα磷酸化水平与单独使用两种药物治疗的细胞的水平进行比较。（F） 在ULK1耗竭和莫鲁辛治疗中对STAT3信号的抑制。将接受morusin处理和ULK1缺失的细胞中Tyr705的STAT3磷酸化水平和Thr172的AMPKα磷酸化水平与接受morussin处理或ULK1耗尽的细胞中的水平进行比较。（G） 通过阻断吗啡素诱导的自噬降低细胞活性。用桑色素和/或3-MA处理HepG2细胞，通过测定MTT代谢活性来测定细胞活力。用DMSO或木霉素处理Mock贫化和ULK1贫化的HeLa细胞，并进行MTT测定。数据表示为平均值±SEM。（H）通过阻断吗啡素诱导的自噬抑制集落形成。用桑色素和/或3-MA处理细胞，用考马斯亮蓝染色细胞后计算菌落数。从三个独立实验中获得的菌落数量以图表形式表示。显示了一个具有代表性的图像。数据表示为平均值±SEM。
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