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.2017年4月10日8:14960。
doi:10.1038/ncomms14960。

内皮细胞LRP1作为PPARγ的共激活物调节代谢反应

附属公司

内皮细胞LRP1作为PPARγ的共激活物调节代谢反应

华茂等。 国家公社. .

摘要

低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)调节肝脏和脂肪组织中的脂质和葡萄糖代谢。它还参与中枢神经系统对食物摄入和瘦素信号的调节。这里我们证明内皮细胞Lrp1调节系统能量稳态。内皮特异性Lrp1缺失的小鼠在高脂饮食诱导的肥胖过程中表现出葡萄糖敏感性和血脂水平的改善,以及氧消耗的增加。我们发现Lrp1的胞内结构域与核受体Pparγ相互作用,Ppar是脂和糖代谢的中央调节器,在内皮细胞中充当其转录共激活物。因此,Lrp1不仅作为内吞受体,而且直接参与基因转录。我们的研究结果表明,内皮细胞在维持系统能量平衡中的功能作用被低估。

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数字

图1
图1。EC-特异性Lrp1基因敲除小鼠在喂食HFD后的体重增加低于其同窝对照小鼠。
()Lrp1体重的变化飞行/飞行;Tie2核心+/−(Cre+或Cre−;由B6繁殖产生;129S7-Lrp1号机组tm2小时/J和B6。在连续16周喂食CC或HFD后,对Cg-Tg(Tek-cre)1Ywa/J小鼠进行监测。(b)与Cre−小鼠相比,HFD喂养16周后,Cre+小鼠的肝脏、附睾脂肪(EF)和腹股沟脂肪(IF)组织块显著降低。组织块按股骨长度(FL)归一化。(c(c)——d日)用油红O(ORO)对肝脏进行染色显示,喂食HFD 16周后,Cre+小鼠的脂质沉积显著减少。中显示的图像c(c)是每组中每只小鼠四个切片的代表性结果。ORO染色信号的定量分析如所示d日. (e(电子)(f))附睾脂肪的H&E染色表明,与HFD喂养16周的Cre−小鼠相比,Cre+小鼠的脂肪细胞较小。中显示的图像e(电子)是每组每只小鼠六个部分的代表性结果。脂肪细胞的大小被量化并显示在(f). ()EC-特异性Lrp1缺失的小鼠(Tie2Pre-mediated缺失和BMT;Cre+/BMT的小鼠)体重增加较低。在HF饮食喂养的整个过程中,测量Cre−/BMT或Cre+/BMT小鼠的体重。(小时)采用双能X射线吸收法测量喂食16周HFD前后小鼠的身体成分。()与Cre−/BMT小鼠相比,患有HFD 16周的Cre+/BMT小鼠的肝脏、附睾脂肪(EF)和腹股沟脂肪(IF)组织质量显著降低。组织块根据胫骨长度(TL)恢复正常。n个=Cre+小鼠为4,Cre−小鼠为5n个=Cre+/BMT小鼠为8,Cre−/BMT小鼠为7*P(P)<0.05. 比例尺,50μm英寸c(c)和100μm英寸e(电子)分析是双向方差分析,然后是Bonferroni(对于)和Fisher的最小显著差异(对于bd日(f)小时)多重比较测试和未配对学生的t吨-测试(针对).
图2
图2。小鼠EC特异性Lrp1缺失导致代谢反应改善。
(——(f))在喂食HFD 16周(分别为第0周和第16周)之前和之后,对Cre+和Cre−小鼠的血浆LDL-C、HDL-C、TG、总胆固醇、脂联素和瘦素水平进行分析。()在整个HFD喂养期间,分别监测Cre+/BMT和Cre−/BMT小鼠的每日食物摄入量。(小时——j个)VO(旁白)2(小时),运动活动x个轴(XTOT,)和z(z)轴(ZTOT,j个)在喂食HFD之前,通过代谢笼研究对小鼠进行了测量。(k个)对HFD前后Cre+/BMT和Cre−/BMT小鼠的空腹血糖和胰岛素水平进行分析。()在喂食HFD之前(第0周),对Cre+/BMT和Cre−/BMT小鼠进行胰岛素耐受性试验。(n个o个)在HFD喂养16周(第16周)后,对Cre+/BMT和Cre−/BMT小鼠进行葡萄糖耐量试验(GTT)。葡萄糖耐量试验曲线下的面积进行了量化,并以o个.n个=Cre+/BMT小鼠为8,Cre−/BMT小鼠为6*P(P)<0.05. 分析是双向方差分析,然后是Fisher最小显著差异多重比较检验(——n个)和未成对学生的t吨-测试(针对).
图3
图3。Lrp1β与Pparγ结合并促进其转录活性。
()用免疫沉淀法(IPed)对HEK 293细胞的裂解物进行免疫沉淀,并用所示抗体进行印迹。(b)用重组Pparγ蛋白进行GST下拉试验。GST-Lrp1-ICD:GST-标记的Lrp1 ICD(GST-ICD;即人类Lrp1的4445–4544)。(c(c))用转染有指示结构的HEK293细胞的裂解物进行Co-IP分析。(d日)用HEK293细胞经10μM吡格列酮(Piog)。(e(电子)(f))体内用Lrp1评估PPRE驱动的荧光素酶活性飞行/飞行;冷却器CAG+/−;PPRE-卢克+(CAG-Core+;PPRE-luc+和CAG-Core-;PPRE-luc+由B6育种产生;129S7-Lrp1号机组tm2小时/J、 B6.Cg-Tg(CAG-cre/Esr1*)5Amc/J和repTOP PPRE-Luc小鼠)。吡格列酮,50或150毫克千克−1。中显示的图像e(电子)是所示小鼠组的代表性结果,并且生物发光强度(BLI)在(f). ()采用实时PCR检测Pdk4 mRNA水平。Lrp1击倒MEF(Lrp1−/−MEF)和Wt(Lrp1+/+MEFs)用10μM吡格列酮。(小时)对内源性Pdk4启动子和阴性DNA区域对照(Neg)进行ChIP-qPCR。稳定的Lrp1β转染HEK293细胞在10时用吡格列酮(Piog)处理μM或棕榈酸(PA),0.524 mMh.用Lrp1或IgG对富集的染色质组分进行IP。(j个)用Flag-Lrp1β-Wt(VGGLL)或Mut(VGGAA)转染HEK293细胞。将其裂解产物与GST融合的重组PparγLBD(PparΓ-LBD)蛋白混合用于IP和免疫印迹。结合的Pparγ-LBD蛋白水平通过测量其条带强度进行量化,并通过富集的Flag-Lrp1β蛋白量进行归一化(j个). (k个)在HEK293细胞中进行Ppar报告分析。()用Flag-tagged Lrp1β-Wt或Mut转染HEK293细胞,用Flag抗体或IgG进行ChIP分析。n个=3,用于细胞培养实验——d日——.n个Lrp1=3飞行/飞行;冷却器CAG+;PPRE-卢克+小鼠和4只用于Lrp1飞行/飞行;CAG员工;PPRE-卢克+老鼠在e(电子)(f). *P(P)<0.05,与对照细胞相比。**#P(P)<0.05. 分析是双向方差分析(ANOVA),然后是Fisher最小显著差异多重比较检验(d日(f)——小时),单向方差分析,然后是Bonferroni(针对k个)和未成对学生的t吨-测试(针对j个).
图4
图4。Lrp1β调节内皮细胞中Pparγ依赖性脂质和葡萄糖基因的诱导。
()Lrp1β在内皮细胞中与Pparγ相互作用。用抗Lrp1 C末端抗体或对照IgG免疫沉淀小鼠心肌源性内皮细胞(MEC)的裂解物,并用western blotting进行分析。(b)MEC中Lrp1基因敲除阻断Ppar转录活性。将PPRE-Luc、renilla和Flag-Pparγ构建物转染到Lrp1 shRNA或对照shRNA稳定转染的MEC中,然后用10μM吡格列酮。n个=3. *P(P)与对照细胞相比,<0.05。#P(P)与转染Flag-Pparγ或吡格列酮治疗的对照sh-MEC相比,<0.05**P(P)与具有相同处理或转染的对照sh-MEC相比。(c(c))Lrp1分离的小鼠内皮细胞荧光素酶活性飞行/飞行;冷却器CAG;PPRE-卢克+(CAG-Core−;PPRE-luc+EC)和Lrp1飞行/飞行;冷却器CAG+;PPRE-卢克+测量(CAG-Core+;PPRE-luc+EC)小鼠。(d日)Lrp1原代小鼠内皮细胞Cd36、Pdk4和C/ebpαmRNA水平飞行/飞行;冷却器CAG+(Cre+)或Lrp1飞行/飞行;冷却器CAG用PCR检测(Cre−)小鼠。相同的细胞用于e(电子)(f). (e(电子)(f))western blotting检测Cd36、Pdk4和C/ebpα蛋白水平。在此之前,用控制载体(C.V.)或指定质粒转染分离的原代小鼠内皮细胞。蛋白质的带强度标准化为肌动蛋白((f)). c(c)——(f)n个=3*P(P)与Cre−细胞相比,<0.05。#P(P)<0.05. 分析是双向方差分析,然后是Fisher最小显著差异多重比较检验(b(f))和未成对学生的t吨-测试(针对c(c)d日).
图5
图5。Pparγ靶基因的mRNA水平受内皮细胞Lrp1缺失的调节。
采用实时荧光定量PCR检测小鼠原代内皮细胞中Cd36、Pdk4和C/ebpαmRNA水平。PCR之前,in,细胞转染Pparγ特异性或对照siRNA,也转染Lrp1β或在10μM或两者兼而有之。b10岁时用吡格列酮治疗Cre+或Cre−ECμM,西格列酮20μM,罗格列酮,20μM,曲格列酮50μM和0.5的棕榈酸mM.英寸c(c)在HFD喂养9周后,从Cre+或Cre−小鼠中分离出细胞。n个=3,对于转染对照或PparγsiRNA的原代内皮细胞和Cre+或Cre−ECb.n个=4只Cre+小鼠和3只Cre−对照小鼠c(c). *P(P)与对照siRNA转染细胞或Cre−对照细胞相比,<0.05。#P(P)与同样处理的对照siRNA-转染细胞或Cre−EC相比,<0.05。分析是双向方差分析,然后是Bonferroni的多重比较试验(c(c))和多个未成对学生的t吨-测试后进行Holm–Sidak校正(针对b).
图6
图6。内皮细胞Lrp1缺失的小鼠在吡格列酮治疗后表现出改善的代谢反应。
()在吡格列酮治疗4周后,分析Cre+/BMT和Cre−/BMT小鼠的代谢参数,包括血浆LDL-C、HDL-C、TG、总胆固醇、脂联素、瘦素、空腹血糖和胰岛素水平。(b)VO(旁白)2、VCO2,运动活动x个轴(XTOT)和z(z)通过代谢笼研究测定吡格列酮治疗后小鼠的axis(ZTOT)和RER(呼吸交换率)。(c(c))吡格列酮治疗后,对Cre+/BMT和Cre−/BMT小鼠进行胰岛素耐受试验(ITT)和葡萄糖耐受试验(GTT)*P(P)<0.05.n个=3,对于Cre+/BMT小鼠和Cre−/BMT小鼠。分析是未配对学生的t吨-测试(针对)和双向方差分析,然后进行Fisher最小显著差异多重比较测试(bc(c)).
图7
图7。Lrp1β调节内皮细胞中Pparγ依赖性胆固醇的内化。
采用20微克毫升−1oxLDL用于测定内化胆固醇含量。()将Lrp1 shRNA或对照shRNA稳定转染的MEC在指定的时间段内装载oxLDL。(b)用oxLDL和10μM吡格列酮24小时小时(c(c))用指定的质粒转染分离的原代MEC。(d日)用Pparγ特异性或对照siRNA转染原代MEC,也用Lrp1β转染或用吡格列酮处理10μM或两者兼而有之。(e(电子))用0.5的棕榈酸处理Cre+或Cre−ECmM用于24小时((f))HFD喂养9周后,从Cre+或Cre−小鼠中分离出EC。n个=3. *P(P)与对照shRNA或siRNA转染的内皮细胞或Cre−对照细胞相比,<0.05。#P(P)与同样处理的对照shRNA转染的内皮细胞或Cre−细胞相比,<0.05,但在c(c)e(电子)(f). **P(P)<0.05. 分析是双向方差分析(ANOVA),然后是Fisher最小显著差异多重比较检验(bd日——(f))和单向方差分析,然后进行Bonferroni测试(针对c(c)).

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引用人

工具书类

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