Determination of the Cell Permissiveness Spectrum, Mode of RNA Replication, and RNA-Protein Interaction of Zika Virus

doi:10.1186/s12879-017-2338-4

.2017年3月31日；17(1):239.

doi:10.1186/s12879-017-2338-4。

寨卡病毒的细胞许可谱、RNA复制模式和RNA-蛋白相互作用的测定

侯望恒¹, 纳杰利卡·阿姆斯特朗¹, 莉莲·阿凯洛·奥布沃洛¹, 托马斯², 庞晓武^三, 凯文·琼斯², 七一汤⁴

附属公司

¹霍华德大学医学院微生物系，Seeley Mudd Building，Room 315，520 W Street，NW，Washington，DC，20059，USA。
²霍华德大学生物系，华盛顿特区，20059，美国。
^三霍华德大学口腔病理学系/牙科学院，华盛顿特区，20059，美国。
⁴霍华德大学医学院微生物系，Seeley Mudd Building，Room 315，520 W Street，NW，Washington，DC，20059，USA。qiyi.tang@howard.edu。

PMID： 28359304
预防性维修识别码：项目编号5374689
内政部： 10.1186/s12879-017-2338-4

寨卡病毒的细胞许可谱、RNA复制模式和RNA-蛋白相互作用的测定

王恒厚等。 BMC感染疾病. 2017.

.2017年3月31日；17(1):239.

doi:10.1186/s12879-017-2338-4。

作者

王恒厚¹, 纳杰利卡·阿姆斯特朗¹, 莉莲·阿凯洛·奥布沃洛¹, 托马斯², 庞晓武^三, 凯文·琼斯², 七一汤⁴

附属公司

¹霍华德大学医学院微生物系，Seeley Mudd Building，Room 315，520 W Street，NW，Washington，DC，20059，USA。
²霍华德大学生物系，华盛顿特区，20059，美国。
^三霍华德大学口腔病理学系/牙科学院，华盛顿特区，20059，美国。
⁴霍华德大学医学院微生物系，Seeley Mudd Building，Room 315，520 W Street，NW，Washington，DC，20059，USA。qiyi.tang@howard.edu。

PMID： 28359304
预防性维修识别码：项目编号5374689
内政部： 10.1186/s12879-017-2338-4

摘要

背景：根据系统发育分析，寨卡病毒有两个谱系：非洲谱系和亚洲谱系。目前尚不清楚这两种毒株在宿主细胞允许性方面是否存在差异，这一信息对于理解病毒的发病机制和设计抗病毒策略非常重要。

方法：在本研究中，我们使用RNA原位杂交（RISH）可视化RNA复制、免疫荧光技术和western blot分析测定病毒蛋白生成，比较研究了非洲株（MR766）和亚洲株（PRVABC59）的人类细胞许可谱，和实时RT-PCR检测病毒RNA增殖水平。实验是在细胞培养条件下进行的。

结果：我们发现了一些人类细胞系，包括成纤维细胞、上皮细胞、脑细胞、干细胞和血细胞，这些细胞对亚洲和非洲株的感染都很敏感。我们没有发现MR766和PRVABC59在允许性、感染率和复制模式方面存在任何差异。与之前的报告（Hamel等人JVI 89:8880-8896，2015）不一致，我们使用RISH或实时RT-PCR发现人类包皮成纤维细胞不允许感染ZIKV。相反，人肺成纤维细胞（MRC-5）完全可以感染ZIKV。令人惊讶的是，通过RNA染色质免疫沉淀（ChIP）分析证明了ZIKV RNA与包膜（E）蛋白（一种结构蛋白）的直接相互作用。在ZIKV RNA基因组中确定了三个与E蛋白相互作用的结合位点。

结论：我们的结果表明，E蛋白可能对病毒RNA复制很重要，不仅提供了指导人类细胞在ZIKV研究中使用的ZIKV许可性信息，还提供了对病毒RNA-E蛋白相互作用的见解，该相互作用可能是通过设计小分子药物进行干预的目标。

关键词：许可性；RNA染色质免疫沉淀（ChIP）；RNA原位杂交；RNA复制；寨卡病毒（ZIKV）。

PubMed免责声明

数字

图1
RISH在不同细胞系中的ZIKV RNA复制。使用ZIKV MR766感染不同的细胞系，如图所示，以0.5的MOI感染24小时。进行IFA以显示病毒蛋白(红色)RISH显示病毒RNA复制(绿色). DAPI用于显示蓝色.比例尺：10μm。一A549，b条ARPE-19，**c（c）**HEK 293T，d日MRC-5，**e（电子）**中国人民银行，**（f）**U-251MG，克SK-N-SH、，小时Cos7公司

图2
实时RT-PCR在不同细胞系中的ZIKV RNA复制。用ZIKV MR766以0.1的MOI感染所述细胞。在X轴指示的时间点收集细胞进行RNA分离。然后使用“方法”一节中所示的引物对RNA样品进行实时RT-PCR

图3
Western blot检测ZIKV蛋白的产生。使用ZIKV MR766感染细胞系，MOI为0.5。在顶部所示的时间（感染后小时数-hpi）采集全细胞裂解物（WCL）样本。使用抗NS3抗体进行Western blot检测病毒蛋白的产生。Tubulin被用作内部样品装载控制

图4
病毒蛋白质在病毒RNA复制之前产生。Vero细胞以0.5的MOI感染ZIKV MR766。细胞分别固定在6、12和24 hpi。IFA和RISH显示了病毒蛋白和RNA的产生。在合并的面板中，RNA显示在绿色，病毒蛋白在红色，DAPI用于显示蓝色.比例尺：10μm

图5
RNA染色质免疫沉淀（ChIP）分析以确定ZIKV蛋白与病毒RNA的相互作用。一ZIKV基因组图和表2中所列引物覆盖的区域：5′侧，从1到1051；3′侧，从10031到10776。b条常规RT-PCR检测RNA ChIP。用ZIKV MR766以0.5的MOI感染Vero细胞24小时。然后用4%甲醛固定细胞。然后对细胞进行声波处理，将RNA剪切至250–500 nt。然后将样本分为3部分：1）输入，2）正常小鼠IgG沉淀，3）抗ZIKV抗体沉淀。在2）和3）中，使用ZIKV感染小鼠或正常小鼠IgG（作为阴性对照）产生的抗ZIKV小鼠血清与珠子一起拉下RNA-蛋白复合物。洗涤3个周期后，用蛋白酶K消化蛋白质，用DNase I（无核糖核酸酶）去除DNA。然后沉淀输入RNA和ChIPed RNA样品，并将样品用于RT-PCR。PCR产物用于运行琼脂糖凝胶并进行可视化。**c（c）**实时RT-PCR检测RNA ChIP。与B相同，但使用了实时RT-PCR。ChIPed RNA或输入RNA的PCR产率归一化为IgG。然后将来自ChIPed RNA的PCR产物的比率与显示为%输入的输入进行比较

图6
ZIKV RNA复制与细胞器的关联。将MR766以0.5的MOI感染Vero细胞24小时。然后用抗Cox IV抗体固定细胞进行红色免疫染色，以显示线粒体（A1-A3），抗Giantin抗体用于显示高尔基体（B1-B3），以及抗Calreticulin用于检测ER（C1-C3）。然后将细胞与ZIKV特异性探针杂交，显示绿色的病毒复制RNA。DAPI显示细胞核为蓝色。比例尺：10μm

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