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.2017年3月30日；12（3）：e0174563。
doi:10.1371/journal.pone.0174563。 2017年电子收集。

心外膜心肌信号的蛋白质组特征揭示了新的调控网络，包括NF-κB在心外膜EMT中的作用

李延阳 1, 亚历山大·厄本 2, 德文·米杜拉 2, 汉斯·乔治·西蒙 2, Q田旺 1
附属公司

心外膜心肌信号的蛋白质组特征揭示了新的调控网络，包括NF-κB在心外膜EMT中的作用

李延阳等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

心外膜和底层心肌之间的信号传递对心脏的正常发育至关重要。这种交流中涉及的复杂分子相互作用和调控网络还没有很好的理解。在本研究中，我们将质谱与生物信息学相结合，系统地表征了鸡胚EPDC-心脏外植体（EHE）共培养的分泌体。建立的150蛋白分泌组数据集极大地扩展了心外膜心肌信号分子参与者的知识库。我们首次确定了与心外膜心肌信号传导相关的蛋白质和通路，以及已知调节心外膜和心肌间串扰的通路的新成分。数据集的巨大规模使生物信息学分析能够推断出特定生物过程的调控网络，并预测网络中的信号转导节点。我们对其中一个预测的节点NF-κB进行了功能分析，并证明NFκB的激活是TGFβ2/PDGFBB诱导的心脏上皮-间充质转化的关键步骤。总之，我们首次对心外膜心肌信号转导形成了一个全球视角，我们的发现为研究心脏发育和再生的分子基础开辟了令人兴奋的新途径。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。质谱用EHE-CM的制备。
鸡心脏0小时外植体的代表性图像（A），24小时EHE共培养（B）和36小时（C）。比例尺：80μm in（A）；40μm英寸（B-C）。（D） 3种独立制剂的银染SDS-PAGE凝胶，CM1-3。（E） CM制剂中TGFβ2和TGFβ3的Western blot。CM，条件培养基；H、 心脏移植；HL，心脏裂解物；A、 心房；五、 心室。
图2
图2。NF-κB调节网络。
巧妙途径分析用于生成EHE分泌体的网络连接。在所描述的网络中，NF-κB被确定为中心节点。节点被描述为形状上的分子名称。阴影形状表示聚焦分子，开放形状表示分子不存在于我们的数据集中，但由于它们与聚焦分子的连接而由IPA放置。单线表示蛋白质相互作用，箭头表示连接分子之间的调节关系。实线表示基因产物之间的直接关系，虚线表示间接关系。标记TGFβ（圆形）和NF-κB（方形）连接节点。
图3
图3。TGFβ2和PDGFBB治疗后NF-κB p65在小鼠原代心外膜细胞中的亚细胞定位。
免疫荧光检测未经治疗（UTD）细胞（A-D）、TGFβ2/PDGFBB处理8小时的细胞（E-H）以及TGFβ2/PDGFBB和BMS345541（I-L）联合处理的细胞中的p65。箭头指向未经处理的细胞，与细胞质染色水平相比，细胞核p65染色升高。比例尺：20μm。p65核质比（M）的Box-and-Whisker图（最小到最大方法，Graphpad Prism）*p<0.0001（Mann-Whitney试验）。
图4
图4。TGFβ2和PDGFBB处理后NF-κB p65在鸡原代心外膜细胞中的亚细胞定位。
免疫荧光检测未经治疗（UTD）细胞（A-D）、TGFβ2/PDGFBB处理8小时的细胞（E-H）以及TGFβ2/PDGFBB和BMS345541（I-L）联合处理的细胞中的p65。概述了DAPI通道中的细胞核，以增强核p65（D，H，L）的可见性。比例尺：20μm。p65核质比（M）的Box-and-Whisker图（最小到最大方法，Graphpad Prism）*第页< 0.05, **第页<0.01（Mann-Whitney检验）。
图5
图5。抑制NF-κB可阻断TGFβ2-和PDGFBB诱导的鸡原代心外膜细胞EMT。
在无TGFβ2/PDGFBB和/或BMS345541的情况下培养原代鸡心外膜细胞48小时。使用相位对比度（A-D）测定细胞形态。用免疫荧光法观察同一细胞内F-actin应激纤维形成（E-H）和β-catenin定位（E'-H'）。比例尺：80μm in（A-D）；40μm英寸（E-H，E'-H'）。qRT-PCR分析工作任务1,基质金属蛋白酶2和DCN公司与TGFβ2/PDGFBB和/或BMS345541（I）处理的细胞相比，未经处理的细胞。误差条表示平均值±标准误差n=3*p＜0.05**p<0.01***p<0.001（学生t检验）。
图6
图6。抑制NF-κB可阻断TGFβ2-和PDGFBB诱导的小鼠心外膜细胞系MEC1的EMT。
在无TGFβ2/PDGFBB和/或BMS345541的情况下培养MEC1细胞48小时。免疫检测同一细胞中的F-actin（A-D）和β-catenin定位（A'-D'）。此外，在同一细胞中测定了ZO1（E-H）和ACTA2阳性应力纤维形成（E’-H’）的表达。比例尺：40μm。
图7
图7。NF-κB p65在小鼠胚胎心外膜表达。
使用针对p65（红色）和cTnT（绿色）的抗体对小鼠E11.5（A-B）和E13.5（C-D）切片进行免疫荧光成像。通过DAPI（蓝色）染色鉴定细胞核。p65蛋白在心外膜和心内膜中富集。在心外膜细胞亚群中观察到核聚积（箭头所示）。虚线描绘了心肌和心外膜之间的边界。比例尺：20μm。
图8
图8。NF-κB p65在鸡胚心外膜中表达。
使用p65（红色）和抗肌球蛋白（MF20）特异性抗体，对来自HH22（A，A'，B，B'）、HH26（C，C'，D，D'）和HH30（E，E'，F，F'）鸡胚的冷冻切片进行免疫组织化学处理。心肌细胞标记物MF20（绿色）标记心肌。细胞核由DAPI（蓝色）检测。矩形标记每个阶段下面板中放大的区域。比例尺：（A'，B'，C'，D'，E'，F'）为50μm；315μm用于（A、B、C、D、E、F）。
图9
图9。心外膜EMT中NF-κB信号功能的建议模型。
TGFβ2和PDGFBB诱导心外膜NF-κB活化，从而上调间充质基因基质金属蛋白酶2和DCN公司以及心外膜细胞标记基因的下调工作任务1.
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