Herpes Simplex Virus 1 UL34 Protein Regulates the Global Architecture of the Endoplasmic Reticulum in Infected Cells

doi:10.1128/JVI.00271-17

.2017年5月26日；91（12）：e00271-17。

doi:10.1128/JVI.00271-17。 2017年6月15日印刷。

单纯疱疹病毒1型UL34蛋白调节感染细胞内质网的整体结构

附属公司

¹日本东京大学医学科学研究所微生物和免疫学系分子病毒学分部。
²日本东京大学医学院国际传染病研究中心传染病控制系。
³日本东京大学医学院微生物与免疫学系分子病毒学分部ykawagu@ims.u-tokyo.ac.jp。

PMID： 28356536
预防性维修识别码：项目编号：5446647
内政部： 10.1128/JVI.00271-17

单纯疱疹病毒1型UL34蛋白调节感染细胞内质网的整体结构

前田富美等。 J维罗尔. 2017.

.2017年5月26日；91（12）：e00271-17。

doi:10.1128/JVI.00271-17。 2017年6月15日印刷。

附属公司

¹日本东京大学医学科学研究所微生物和免疫学系分子病毒学分部。
²日本东京大学医学院国际传染病研究中心传染病控制系。
³日本东京大学医学院微生物与免疫学系分子病毒学分部ykawagu@ims.u-tokyo.ac.jp。

PMID： 28356536
预防性维修识别码：项目编号：5446647
内政部： 10.1128/JVI.00271-17

摘要

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染后，CD98重链（CD98hc）在核膜（NM）周围重新分布，在核衣壳核出口期间促进病毒发育。在本研究中，我们试图确定参与CD98hc积聚的因子，并证明以下内容：（i）HSV-1 UL34的零突变导致CD98hc-和HSV-1发育调节因子糖蛋白B和H（gB和gH）在细胞质中的特异性分散；（ii）如CD98hc、gB和gH所观察到的，野生型HSV-1感染导致内质网（ER）标记物calnexin和ERp57在NM周围重新分布，而UL34-完全突变导致这些标记物的细胞质分散；（iii）ER标记在HSV-1感染细胞中有无UL34的情况下与CD98hc、gB和gH有效共定位；（iv）在超微结构水平上，野生型HSV-1感染导致内质网周围内质网受压，而UL34-完全突变导致内质网膜细胞质弥散；和（v）UL34-null突变显著降低了NM的层粘连蛋白标记与CD98hc和gB的共定位效率。总的来说，这些结果表明，HSV-1感染导致内质网周围内质网的重新分布，导致内质网膜周围内质网络相关CD98hc、gB和gH的积聚，并且UL34是内质网重新分布以及内质网相关发育障碍因子有效补充的必要条件。我们的研究表明，HSV-1诱导全球内质网结构重塑，以招募调节因子介导病毒核向NM的出口。重要性内质网是一种重要的细胞器，以复杂网络的形式存在于细胞质中。虽然病毒经常重塑内质网以促进病毒复制，但关于疱疹病毒感染对内质网形态完整性影响的信息有限。在这里，我们表明HSV-1感染导致NM周围的全球内质网结构受压，导致与HSV-1核衣壳核出口相关的内质网相关调节因子积聚。我们还确定HSV-1 UL34是介导内质网重构的病毒因子。此外，我们证明，UL34是有效地将这些调节器瞄准NM所必需的。据我们所知，这是第一份显示疱疹病毒重塑ER全球结构的报告。我们的研究还深入了解了HSV-1核出口的调节因子被招募到NM的机制，这种病毒事件就是在NM发生的。

关键词：呃；单纯疱疹病毒；细胞器结构。

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数字

图1
野生型HSV-1（F）基因组结构示意图以及本研究中产生的重组病毒的相关域。1、野生型HSV-1（F）基因组；2、UL33至UL35基因的结构域；3、UL34基因的结构域；4和5，UL34基因突变的重组病毒。

图2
本研究中产生的UL34-Vero细胞和重组病毒的特征。（A）（左）用所示抗体进行免疫印迹分析，以模拟感染或感染野生型HSV-1（F）或YK722（ΔUL34）的Vero和UL34-Vero细胞，MOI为5，持续18 h。（右）用所示抗体进行免疫印迹分析，以模拟感染或感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair）的HEp-2细胞，MOI为5，持续24小时。（B） HEp-2细胞在MOI为5（左）或0.01（右）时感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair）。从细胞培养上清液和感染细胞中采集总病毒，并在UL34-Vero细胞上进行分析。（C） HEp-2细胞模拟感染或感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair），MOI为5，持续24小时，然后固定、渗透，用指示的抗体染色，并用共焦显微镜检查。比例尺，10μm。

图3
CD98hc在HSV-1感染细胞中的定位。HEp-2细胞在MOI为5时模拟感染或感染野生型HSV-1（F）24小时，然后固定、渗透，用抗CD98hc抗体结合抗钙粘蛋白（A）或抗层粘连蛋白A/C（B）染色，并用共聚焦显微镜检查。比例尺，10μm。

图4
gH、gB或UL31突变对HSV-1感染细胞中CD98hc定位的影响。HEp-2细胞模拟感染或感染野生型HSV-1（F）（A至D）、YK713（ΔgH）（A）、YK 701（Δg B）（B）、R7040（ΔUs3）（C）或YK720（ΔUL31）（D），MOI为5，持续24小时，然后固定、渗透，用指示抗体染色，并用共焦显微镜检查。比例尺，10μm。

图5
UL31或Us3突变对HSV-1感染细胞中UL34和/或UL31定位的影响。HEp-2细胞模拟感染（A）或感染野生型HSV-1（F）（A和B）、YK720（ΔUL31）（A）或者R7040（ΔUs3）（B），MOI为5，持续24小时，然后固定、渗透，用指示的抗体染色，并用共聚焦显微镜检查。比例尺，10μm。

图6
β1整合素敲除对HSV-1感染细胞CD98hc定位的影响。（A）用所示抗体进行免疫印迹分析β1整合素在sh-Luc-HEp-2和sh-β1整合素-HEp-2中的表达。（B）将sh-Luc-HEp-2和sh-β1整合素HEp-2细胞以5的MOI模拟感染或感染野生型HSV-1（F）24小时，然后固定、透化、用所示抗体染色，并通过共聚焦显微镜检查。比例尺，10μm。

图7
UL34突变对HSV-1感染细胞中CD98hc定位和积累的影响。（A和B）HEp-2细胞在MOI为5时模拟感染或感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair）24小时。细胞固定、渗透，用抗CD98hc抗体结合抗钙粘蛋白（A）或抗层粘蛋白A/C（B）抗体染色，并用共聚焦显微镜检查。比例尺，10μm。（C）用所示抗体对细胞进行免疫印迹分析。

图8
UL34突变对HSV-1感染细胞中gB（A）和gH（B）定位以及CD98hc与gB（C）或gH（D）共定位的影响。HEp-2细胞模拟感染或感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair），MOI为5，持续24小时，然后固定、渗透，用指示的抗体染色，并用共焦显微镜检查。比例尺，10μm。

图9
UL34突变对ER标记物calnexin（A）和ERp57（B）在HSV-1感染细胞中定位的影响。HEp-2细胞模拟感染或感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair），MOI为5，持续24小时，然后固定、渗透，用指示的抗体染色，并用共焦显微镜检查。比例尺，10μm。

**图10**
UL34突变对ER标记物ERp57（A）和calnexin（B和C）与HSV-1感染细胞中每个发育不良因子CD98hc（A）、gB（B）和gH（C）共定位的影响。HEp-2细胞模拟感染或感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair），MOI为5，持续24小时，然后固定、渗透，用指示的抗体染色，并用共焦显微镜检查。比例尺，10μm。

**图11**
UL34突变对HSV-1感染细胞超微结构水平ER分布的影响。HEp-2细胞在MOI为30时模拟感染（A）或感染野生型HSV-1（F）（B）、YK722（ΔUL34）（C）或YK723（ΔUL34-repair）（D）24小时；嵌入的；分段；玷污的；并用透射电子显微镜检查。箭头表示ER.Nu，核心；Cy，细胞质。比例尺，1μm。

**图12**
calnexin和CD98hc在体外表达UL34和/或UL31的细胞或HSV-1感染细胞中的定位。将空质粒（A至D）、UL34表达质粒（A和C）或UL34和UL31表达质粒（B和D）转染HEp-2细胞48小时，然后用抗钙连蛋白（A和B）或抗CD98hc（C和D）抗体结合所示抗体固定、渗透、染色，并用共焦显微镜检查。（E） HEp-2细胞在MOI为5时模拟感染或感染野生型HSV-1（F）24小时，然后固定、渗透，用抗UL34抗体和抗calnexin抗体染色，并用共焦显微镜检查。比例尺，10μm。

**图13**
UL34突变对HSV-1感染细胞中NM标记与gD、gB或CD98hc共定位的影响。HEp-2细胞在MOI为5时感染野生型HSV-1（F）、YK722（ΔUL34）或YK723（ΔUL34-repair）24 h，然后固定；透化；用抗核蛋白B1（A和B）或抗核蛋白A/C（C）与抗gD（A）、抗gB（B）或抗CD98hc抗体（C）联合染色；并用共焦显微镜检查。使用Manders的共定位系数量化gD和层粘连蛋白B1（A）、gB和层粘着蛋白B1（B）或CD98hc和层粘连蛋白A/C（C）之间的共定位。每个值都是平均值和标准误差(n个=40），并相对于野生型HSV-1（F）感染HEp-2细胞的平均值进行表达，其标准化为1。采用Tukey检验进行单因素方差分析进行统计分析；不另作说明，不重要。

**图14**
通过共焦显微镜检测UL34突变对HSV-1感染细胞中gD（A）、gB（B）或CD98hc（C）总荧光强度的影响。使用ZEN软件（Zeiss）获得图13中分析的感染HEp-2细胞中每个细胞的总强度。每个值都是平均值和标准误差(n个=40），并相对于野生型HSV-1（F）感染HEp-2细胞的平均值进行表达，其标准化为1。采用Tukey检验进行单因素方差分析进行统计分析；不另作说明，不重要。

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1. Roizman B，Knipe DM，Whitley RJ.2013年。单纯疱疹病毒，第1823-1897页。在Knipe DM、Howley PM、Cohen JI、Griffin DE、Lamb RA、Martin MA、Racaniello VR、Roizman B（ed）、Fields病毒学、第六版Lippincott Williams&Wilkins，宾夕法尼亚州费城。
1. Johnson DC、Baines JD。2011年。疱疹病毒重塑宿主膜，以便于病毒传播。《自然微生物评论》9:382–394。doi:10.1038/nrmicro2559。-内政部-公共医学
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1. Reynolds AE、Ryckman BJ、Baines JD、Zhou Y、Liang L、Roller RJ.2001。单纯疱疹病毒1型的U（L）31和U（L）34蛋白形成一个复合物，积聚在核边缘，是包裹核衣壳所必需的。《病毒杂志》75:8803–8817。doi:10.1128/JVI.75.18.8803-8817.2001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Roller RJ、Zhou Y、Schnetzer R、Ferguson J、DeSalvo D.2000。病毒包膜需要1型单纯疱疹病毒U（L）34基因产物。《维罗尔杂志》74:117–129。doi:10.1128/JVI.74.1.117-129.2000。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Roizman B，Knipe DM，Whitley RJ.2013年。单纯疱疹病毒，第1823-1897页。在Knipe DM、Howley PM、Cohen JI、Griffin DE、Lamb RA、Martin MA、Racaniello VR、Roizman B（ed）、Fields病毒学、第六版Lippincott Williams&Wilkins，宾夕法尼亚州费城。

[2] Roizman B，Knipe DM，Whitley RJ.2013年。单纯疱疹病毒，第1823-1897页。在Knipe DM、Howley PM、Cohen JI、Griffin DE、Lamb RA、Martin MA、Racaniello VR、Roizman B（ed）、Fields病毒学、第六版Lippincott Williams&Wilkins，宾夕法尼亚州费城。

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[4] Johnson DC、Baines JD。2011年。疱疹病毒重塑宿主膜，以便于病毒传播。《自然微生物评论》9:382–394。doi:10.1038/nrmicro2559。-内政部-公共医学

[5] Mettenleiter TC、Muller F、Granzow H、Klupp BG，2013年。出路：我们所知道和不知道的疱疹病毒核出口。细胞微生物学15:170–178。doi:10.1111/cmi.12044。-内政部-公共医学

[6] Mettenleiter TC、Muller F、Granzow H、Klupp BG，2013年。出路：我们所知道和不知道的疱疹病毒核出口。细胞微生物学15:170–178。doi:10.1111/cmi.12044。-内政部-公共医学

[7] Reynolds AE、Ryckman BJ、Baines JD、Zhou Y、Liang L、Roller RJ.2001。单纯疱疹病毒1型的U（L）31和U（L）34蛋白形成一个复合物，积聚在核边缘，是包裹核衣壳所必需的。《病毒杂志》75:8803–8817。doi:10.1128/JVI.75.18.8803-8817.2001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Reynolds AE、Ryckman BJ、Baines JD、Zhou Y、Liang L、Roller RJ.2001。单纯疱疹病毒1型的U（L）31和U（L）34蛋白形成一个复合物，积聚在核边缘，是包裹核衣壳所必需的。《病毒杂志》75:8803–8817。doi:10.1128/JVI.75.18.8803-8817.2001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Roller RJ、Zhou Y、Schnetzer R、Ferguson J、DeSalvo D.2000。病毒包膜需要1型单纯疱疹病毒U（L）34基因产物。《维罗尔杂志》74:117–129。doi:10.1128/JVI.74.1.117-129.2000。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Roller RJ、Zhou Y、Schnetzer R、Ferguson J、DeSalvo D.2000。病毒包膜需要1型单纯疱疹病毒U（L）34基因产物。《维罗尔杂志》74:117–129。doi:10.1128/JVI.74.1.117-129.2000。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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