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.2017年5月26日;91(12):e00232-17。
doi:10.1128/JVI.00232-17。 打印2017年6月15日。

SGTA依赖性调节Hsc70促进猿病毒40从内质网进入细胞质

附属公司

SGTA依赖性调节Hsc70促进猿病毒40从内质网进入细胞质

艾莉森·杜普日克等。 J维罗尔. .

摘要

非隐匿病毒的膜渗透仍然是个谜。在非包膜多瘤病毒猴病毒40(SV40)的情况下,病毒穿透内质网(ER)膜到达胞浆,然后进入细胞核引起感染。我们之前证明,细胞溶质Hsc70-SGTA-Hsp105复合物与内质网膜相连,其中Hsp105和SGTA有助于从内质网中提取SV40,并将病毒运输到胞浆中。我们现在发现,Hsc70也在SGTA调节的一个步骤中将SV40从内质网排出到胞浆中。虽然SGTA的N末端结构域在SV40的ER-胞浆转运过程中是不必要的,它介导同二聚体化并招募细胞适配器,但该结构域似乎在SV40进入时发挥了意外的ER后膜移位功能。因此,我们的研究确立了Hsc70-SGTA-Hsp105复合物中Hsc70在促进SV40 ER向胞质溶胶膜渗透方面的关键功能,并揭示了SGTA在控制这一步骤中的作用。重要性一种非包膜病毒如何通过生物膜传播而引起感染仍然是个谜。一个令人费解的步骤是,宿主细胞溶质成分是否协同将病毒颗粒转运到细胞溶质中。在非包膜多瘤病毒SV40的ER-细胞膜转运过程中,一个决定性的感染步骤,由Hsc70-SGTA-Hsp105组成的细胞溶质复合体先前被证明与ER膜相关。SGTA和Hsp105已被证明能从内质网中提取SV40并将病毒运输到胞浆中。我们在这里证明了Hsc70在SV40 ER细胞溶质渗透中的关键作用,并揭示了SGTA如何控制Hsc70影响这一过程。

关键词:监护人;内质网;膜转运;猴病毒40。

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数字

图1
图1
Hsc70缺失会损害SV40细胞液从内质网到达。(A)转染Hsc70 siRNA 1、Hsc70 siRNA 2或干扰siRNA的CV-1细胞被纯化的SV40感染16小时,并接受半渗透的ER-细胞液转运分析。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析细胞溶胶、膜和ER定位部分(见材料和方法)。(B) 使用ImageJ(美国国立卫生研究院)对A组细胞溶质组分中的VP1带强度进行量化,并将其绘制为加扰siRNA-处理条件下VP1带密度的百分比。该图表示三个生物复制品的平均值±SD。(C) 与面板B中相同,只是量化了ER-localized分数中的VP1带强度。(D) 将转染有Hsc70 siRNA 1或打乱siRNA的CV-1细胞用霍乱毒素中毒90分钟。用0.1%洋地黄素溶解细胞,并像A组一样进行分馏。对细胞液和细胞膜部分进行SDS-PAGE和免疫印迹。
图2
图2
敲除Hsc70或SGTA可增强SV40诱导的病灶形成。(A) 将CV-1细胞接种在玻璃盖玻片上,同时转染Hsc70 siRNA 1(底部行)或打乱siRNA(顶部行)。siRNA转染24小时后,将细胞感染SV40(MOI为~4至5)16小时。在16 hpi时,固定细胞,并对其进行BAP31(红色)和VP1(绿色)染色,并使用荧光显微镜进行成像。显示合并图像中白色方框区域的缩放图像(3×)。(B) 数据被绘制为含有至少一个BAP31焦点的细胞的数量,作为扰乱的siRNA处理条件的百分比。该图表示三个生物复制品的平均值±SD。(C) 与面板A中相同,只是显示了由SGTA siRNA 2处理的细胞生成的图像。(D) 与B组相同,但C组的病灶形成是基于SGTA siRNA 1和siRNA 2的结果进行量化的。
图3
图3
SGTA调节SV40-Hsc70相互作用。(A) 将打乱或SGTA siRNA 1转染的CV-1细胞与Hsc70-S共转染24 h,然后感染16 h SV40。从产生的全细胞裂解物中亲和纯化Hsc70-S,并对分离的样品进行SDS-PAGE和免疫印迹。(B) 将面板A中VP1带强度量化为干扰siRNA-处理细胞的百分比。该图表示三个生物复制品的平均值±SD。(C) 与A组相同,除了转染Hsc70-S的COS-7细胞与GFP-FLAG或WT SGTA-Myc/FLAG共转染外,WT SGTA Myc/FLAG降级。(D) 以表达GFP-FLAG的细胞百分比量化C组VP1带强度。该图表示三个生物复制品的平均值±SD。(E) 纯化的GFP-FLAG和Hsc70-His经考马斯蓝染色。(F) Hsc70-His和GFP-FLAG与DTT-EGTA处理的SV40孵育,然后与VP1特异性抗体孵育。沉淀样品进行SDS-PAGE和免疫印迹。
图4
图4
SGTA突变体的特征。(A) 图中使用的WT和SGTA突变体的结构。(B)使用FLAG抗体结合琼脂糖珠对来自转染有指示结构的HEK293T细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀。沉淀材料进行SDS-PAGE和免疫印迹。(C) 与面板B中的相同,但使用了指示的构造。白色的插入空间表明泳道是从相同的免疫印迹拼接而来的。
图5
图5
SGTA与Hsc70结合的能力在促进SV40 ER向胞浆转运方面很重要。(A) 用打乱或SGTA siRNA 1转染COS-7细胞24小时后,用所示的构建物进行共转染。然后用SV40感染细胞16小时,裂解并分离,如图1A所示。对细胞溶胶和ER-localized组分进行非还原性SDS-PAGE和免疫印迹。(B) 与面板A中的相同,但使用了指示的构造。(C) 面板A和B中细胞溶质部分的VP1带强度的量化。VP1带的强度量化为干扰siRNA-处理条件的百分比。数据表示至少三个生物重复的平均值±SD。
图6
图6
SGTA的N末端结构域和Hsc70结合对促进SV40感染至关重要。(A) 将转染GFP-FLAG、WT SGTA-Myc/FLAG或突变SGTA-Mmy/FLAG的CV-1细胞接种在玻璃盖玻片上24 h,并转染打乱或SGTA siRNA 1。siRNA转染24小时后,细胞被SV40(MOI为~1)感染20小时。然后固定、染色并计数细胞。只对表达FLAG蛋白的细胞进行评分。每个生物复制至少统计100个细胞。该图表示至少三个生物复制品的平均值±SD。(B) 用SGTA siRNA 1转染COS-7细胞24 h,然后用GFP-FLAG或ΔN SGTA-Myc/FLAG转染24 h。DNA转染24小时后,用SV40(MOI为~3~4)感染细胞16 h。16 hpi时,细胞与DSP交联,在1%DBC中溶解,免疫沉淀。对样品进行SDS-PAGE并用所示抗体进行免疫印迹。(C) 该模型描述了在内质网提取和病毒胞质到达期间,SGTA依赖性调节Hsc70的作用。焦点代表假定的病毒胞浆进入位点。插图显示了SGTA控制SV40-Hsc70相互作用的两种可能机制。有关更多详细信息,请参阅讨论。

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