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.2017年4月6日；544(7648):53-58.
doi:10.1038/nature21693。 Epub 2017年3月29日。

髓细胞祖细胞簇的形成驱动紧急和白血病骨髓生成

奥雷利·海罗 1, 米哈伊尔·宾纽伊斯 1, 梁静茹（Stephanie Leong） 1, 费尔南多·卡莱罗·尼埃托 2, 张思毅（Si Yi Zhang） 1, Yoon-A Kang（尹安康） 1, 王晓楠 2, 埃里克·彼得拉斯 1, S海华楚 三, 基根·巴里·霍尔森 1, 斯科特·阿姆斯特朗 三, Berthold Göttgens公司 2, Emmanuelle Passegué 1
附属公司

髓系祖细胞簇的形成推动了紧急和白血病骨髓生成

奥雷利·海罗等。 性质. .

摘要

虽然对血液生成的许多方面都有很好的了解，但骨髓中髓样细胞分化的空间组织仍然未知。在这里，我们使用成像技术跟踪小鼠在紧急和白血病骨髓生成期间的粒细胞/巨噬细胞祖细胞（GMP）行为。在稳定状态下，我们发现单个GMP散布在骨髓中。在再生过程中，我们观察到扩张的GMP斑块形成明确的GMP簇，进而局部分化为粒细胞。重要骨髓生态位信号（SCF、IL-1β、G-CSF、TGFβ和CXCL4）的定时释放以及可诱导Irf8和β-catenin祖细胞自我更新网络的激活控制了再生GMP簇的瞬时形成。在白血病中，我们发现由于自我更新网络的持续激活和缺乏正常恢复造血干细胞静止的终止细胞因子，GMP簇不断产生。我们的研究结果揭示了先前未被识别的原位GMPs的动态行为，它调节紧急骨髓生成，并在白血病中被劫持。

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利益冲突声明

作者信息.作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

扩展数据图1
扩展数据图1。正常和白血病条件下的GMP成像
一Gating策略用于识别GMP，显示具有代表性的FACS图，纯化的GMP（紫色）用IF标记染色，骨切片上有代表性的WT-GMP（紫色圆圈）。b条，可诱导Scl-tTA：：TRE-BCR/ABL（BA）和本构6月B日弗洛克斯：：MORE-Core（jB）具有代表性GMP FACS图的人类MPN小鼠模型。Ctrl：控制；药物：强力霉素。c（c）代表性IF染色显示患病jB小鼠BM中的GMP（紫色）。d日，BA小鼠在停药后指定周（wks）cGMP形成与疾病发展的进展。e（电子），WT和BA小鼠中松散pGMP和紧密cGMP的典型示例。实线表示骨骼表面，虚线表示cGMP和星形pGMP。
扩展数据图2
扩展数据图2。GMP集群特征
一，WT和患病BA和jB脾脏中GMPs（紫色）的代表性IF染色。b条，在移植MLL-AF9（MF9）转导的LSK衍生细胞后发展为AML的受体小鼠中的cGMPs。对照组（Ctrl）和患病MF9受体BM中GMP（紫色）的实验方案和代表性IF染色。显示三只单独的MF9受体小鼠。c（c），代表性IF染色显示与Ctrl和患病BA BM中所示基质特征（绿色）相关的MP（红色）。d日代表性IF染色显示，在Ctrl和患病的BA BM中，MP（红色）与成熟淋巴（绿色）和髓样（蓝色）细胞相关。点线表示cGMP；i和ii突出显示两个放大区域。橙色线表示生发中心，箭头表示单个GMP，星形pGMP和虚线cGMP。
扩展数据图3
扩展数据图3。5-FU处理后的BM再生
一Gating策略用于通过流式细胞术在5-FU处理的WT小鼠中识别指示的BM群体。典型的FACS曲线显示在治疗后的指定天数。b条、5-FU治疗后指定天数BM LSK、HSC、MPP2/3、GMP和Gr的频率。c（c），代表性IF染色显示5-FU治疗后指定天数的BM中的GMP（紫色）。值得注意的是，在所有研究的骨骼中都观察到了cGMP(即.、股骨、胫骨、肱骨和胸骨）。实线表示骨骼表面，虚线表示cGMP。结果表示为平均值±S.D.（灰色条，参考范围）*p≤0.05，**p<0.01，***p<0.001。
扩展数据图4
扩展数据图4。髓系再生和扩张过程中的GMP簇
一Ly-6G治疗小鼠的BM中Gr耗竭，采用实验方案和代表性FACS图，并在治疗后指定天对GMP（紫色）进行IF染色。b条G-CSF处理小鼠BM的Gr扩张，采用实验方案和典型的FACS图，并在治疗后指定的天数对GMP（紫色）进行IF染色。c（c）实验方案和移植后指定周（wks）GMP（紫色）代表性IF染色的HSC移植小鼠BM中的GMP簇。显示未移植WT BM用于比较。虚线表示cGMP和星形pGMP。
扩展数据图5
扩展数据图5。GMP簇是克隆的
a–c，再生GMP簇的克隆性：（a）CD45.2百分比+在5-FU治疗前和治疗后指定天数内使用的嵌合体小鼠的外周血（PB）细胞数（n=2-3只小鼠/组）；（b） 代表性IF染色显示治疗后指定天数5-FU处理的嵌合体BM中MPs（红色）和CD45.2（绿色）的表达；和（c）实验方案和代表性IF染色显示MPs（红色）和CD45.2（绿色）分别在两个独立的d12 5-FU处理的嵌合体BM中表达。阳性（+）簇的CD45.2≥75%+细胞和阴性（−）簇≤5%CD45.2+细胞。工作时间：周。d日，白血病GMP簇的克隆性，实验方案和代表性IF染色显示来自β-肌动蛋白-Gfp患病BA嵌合体BM中的细胞。阳性（+）簇具有≥75%的GFP+细胞和阴性（-）簇≤5%GFP+细胞。虚线表示cGMP。
扩展数据图6
扩展数据图6。再生GMP簇的动态增殖和分化
一，代表性FACS图显示了5-FU处理的WT小鼠在治疗后指定天的LSK和GMP中BrdU掺入的动力学。b条，代表性IF染色显示MPs（红色）与增殖的EdU相关+（绿色，上排）并划分pH3+在治疗后指定的天数，5-FU处理的WT BM中的（绿色，下行）细胞。c（c）代表性IF染色显示，在治疗后指定的天数内，5-FU处理的WT BM中MPs（红色）与成熟淋巴（绿色）和髓样（蓝色）细胞相关。
扩展数据图7
扩展数据图7。再生和白血病GMP簇中的分子重编程
一，对5-FU治疗的WT小鼠在治疗后指定天数（n=2；10-16池100个细胞/条件）分离的再生GMP进行额外的Fluidigm基因表达分析。结果表示为与未经处理（D0）GMP水平相比的折叠变化，并以箱线图表示（线：中位数；方框：25第个和75第个百分位数；胡须：90第个和10第个百分位数）。b条，加载再生GMP中Fluidigm基因表达数据的主成分（PC）分析关联。c（c），5-FU处理的GMP中GFP表达的代表性FACS图Csf1r-全球粮食计划署报告鼠在治疗后的指定天数内。d日从患病BA、jB和相应年龄匹配的Ctrl小鼠（n=4；22–28个100细胞/条件的池）分离的MPN GMP的Fluidigm基因表达数据的tSNE分析和PC分析的负荷关联。e（电子）PC分析单细胞GMP RNA-Seq数据，显示每个5-FU时间点（D0:89细胞；D8:187细胞；D10:89细胞、D12:75细胞；D14:36细胞）和单个Ctrl（94细胞）和BA（BA（1）：68细胞；BA（2）：57个细胞；BA（3）：87细胞）小鼠。
扩展数据图8
扩展数据图8。Irf8型和β-连环蛋白自我更新GMP中的功能
一，代表性FACS图，显示了稳态下的GMP和GrsIrf8型+/+和Irf8型−/−老鼠。b条，实验方案Irf8型+/+和Irf8型−/−BM嵌合小鼠。c（c），供体衍生CD45.2的代表性IF染色+经5-FU处理的（绿色）MP（红色）Irf8型+/+和Irf8型−/−BM嵌合小鼠。d日HSC、MPP3和MPP4中的核β-连环蛋白Irf8型+/+和Irf8型−/−老鼠。结果以阳性细胞百分比表示。e（电子）,（f），实验方案Ctnb1号机组Ctrl键和Ctnb1号机组（e） 功能丧失（LOF）或功能增强（GOF）小鼠。星号表示pGMP和虚线cGMP。结果表示为平均值±S.D。
扩展数据图9
扩展数据图9。再生过程中GMP簇形成的控制机制
一，ELISA法测定5-FU处理的WT小鼠在治疗后指定天数的骨髓液中细胞因子水平。b条，5-FU治疗后指定天数内BM血管渗漏的量化。结果表示为层粘连蛋白掩蔽后的龙绿（DG）微球MFI+血管。c（c），典型的IF染色显示5-FU治疗的BM中的GMP（紫色），同时在第8-11天每天注射G-CSF（+G）。d日，5-FU处理的调查Il1r1型+/+和Il1r1号机组−/−治疗后指定天数的小鼠表现出具有代表性的GMP IF染色（紫色）、Gr再生的FACS图以及指定BM群体的量化。e（电子）CD150的代表性IF染色+5-FU-和Ly-6G-处理骨髓中的巨核细胞（红色）。（f）,克，注射白喉毒素（DT）的巨核细胞耗竭研究iDtr公司（Ctrl）和Cxcl4-Cre:iDtr公司(Cre公司)小鼠表现出CD150的代表性IF染色+5-FU后指定天数的巨核细胞（红色），以及5-FU之后第12天HSC的代表性Ki67/DAPI染色。星号表示pGMP和虚线cGMP。结果表示为平均值±S.D.（灰色条，参考范围）*p≤0.05**p≤0.01，***p≤0.001。
扩展数据图10
扩展数据图10。白血病小鼠GMP簇的形成
一，ELISA测量BA、jB和相应Ctrl小鼠骨髓液中的细胞因子水平。b条，qRT-PCR测量Cxcl4公司Ctrl和BA小鼠BM和Meg-enriched BSA梯度中的表达。c（c）定量病变BA、jB和相应的Ctrl-BM中的血管渗漏。结果被量化为层粘连蛋白掩蔽后的龙绿（DG）微球MFI+血管。d日，典型的FACS图显示5-FU处理的Ctrl和BA小鼠在治疗后指定的天数内的Gr再生。e（电子），修订的紧急骨髓生成模型。在稳定状态下，血液生成反映了HSC对少量髓系感染MPP2/3和大量淋巴细胞感染MPP4的差异生成，这两者都会产生GMP并有助于髓系输出。相反，在紧急情况下，由于细胞因子刺激和特定调节途径的触发，HSC被诱导过度产生MPP2/3，MPP4被重新编程为几乎唯一的髓系输出。髓系再生轴激活的一个重要结果是在骨髓腔内产生局部pGMP/cGMP分化灶，从而导致粒细胞过度生成。整个过程受到BM生态位信号的严格调控，在紧急骨髓生成期间是短暂的，但在髓系白血病中持续激活。新出现的重要问题是，如果扩展的MPP2/3和髓系重编程MPP4也产生pGMP/cGMP或继续产生常规GMP（虚线），是什么控制着从自我更新（SR）pGMP向分化（different）cGMP簇的转变，以及通过该再生轴产生的Grs在功能上是否与稳态Grs不同（异质性）。结果表示为平均值±SD*p≤0.05，***p≤0.001。
图1
图1。白血病和再生性骨髓生成中的GMP簇
一,b条，代表性IF染色显示（a）野生型（WT）和（b）患病骨髓中的GMP（紫色）Scl-tTA：TRE-BCR/ABL（BA）小鼠。实线表示骨骼表面，虚线表示cGMP，箭头表示单个GMP。c（c）5-FU处理的WT小鼠的PB（n=5）和BM再生。d日，5-FU治疗后指定天数造血细胞数量的变化。e（电子）代表性IF染色显示5-FU治疗小鼠骨髓中的GMP（紫色）。星号表示pGMP和虚线cGMP。结果表示为平均值±S.D.（灰色条，参考范围）**p<0.01，***p<0.001。
图2
图2。GMP集群是分化的焦点
一，5-FU处理的WT小鼠中的增殖，显示实验方案和BrdU在LSK和GMPs中的掺入。b条Ctrl和BA小鼠（n=3）的GMP中加入BrdU。c（c），代表性IF染色显示MPs（红色）与增殖的EdU相关+（绿色，上排）并划分pH3+Ctrl和BA BM中的（绿色，下一行）单元格。d日，GMP簇外围的代表性IF染色（虚线）突显分化GMP（箭头），因为它们失去FcγR表达并获得谱系标记表达。e（电子），5-FU处理的WT小鼠（n=4；*，与.电镀效率；•，与.转基因菌落；°,与.M菌落）。结果为菌落类型百分比，图片显示有代表性的菌落。GM：粒细胞/巨噬细胞，Gr：粒细胞，M：巨噬细胞，菌落。星号表示pGMP和虚线cGMP。结果表示为平均值±S.D.（灰色条，参考范围）*p≤0.05，**p≤0.01，****p≤0.001。
图3
图3。GMP簇形成的分子机制
一，对从5-FU处理的WT小鼠（n=2；10–16个100细胞池/条件）分离的GMP中Fluidigm基因表达数据的tSNE分析。b条，从Fluidigm分析中选择的基因如（a）所示。结果表示为与d0 GMP中的水平相比的折叠变化，并表示为箱线图（线：中值；框：25第个和75第个百分位数；须：90第个和10第个百分位数）。c（c），从BA、jB和相应年龄匹配的Ctrl小鼠（n=4；22–28个100细胞/条件的池）分离的GMP的Fluidigm分析中选择的基因。结果表示为与相应控制GMP中的水平相比的折叠变化，如（b）所示。d日对5-FU处理的WT小鼠（476个单细胞）和BA小鼠（306个单电池）分离的GMP的单细胞RNA-Seq数据进行PC分析。e（电子）5-FU处理的WT小鼠、Ctrl和BA小鼠中稳态GMP（ssGMP）和自我更新GMP（srGMP）的频率*p≤0.05**p≤0.01，***p≤0.001。
图4
图4。Irf8/β-catenin自我更新祖细胞网络
一，5-FU处理的GMP（紫色）的代表性IF染色Irf8型+/+和Irf8型−/−BM公司。b–d段，核β-catenin in（b）来自d8 5-FU处理的WT小鼠的GMP，d0 GMP呈现典型的阴性（−）和阳性（+）染色，（c）来自BA、jB和相应年龄匹配的Ctrl小鼠的GM，以及（d）来自Irf8型+/+和Irf8型−/−老鼠。结果以阳性细胞百分比表示。e（电子）,Irf8型GMP中的表达Ctnb1号机组获得功能（GOF）和丧失功能（LOF）小鼠。（f），GMP的代表性IF染色（紫色）Ctnb1号机组Ctrl和GOF BM。克，5-FU处理的GMP（紫色）的代表性IF染色Ctnb1号机组Ctrl和LOF BM。小时控制pGMP自我更新（SR）和cGMP分化（diff）的分子网络模型。红色表示激活和绿色抑制，虚线突出显示MPN中的再诱导途径。星号表示pGMP和虚线cGMP。结果表示为平均值±S.D.（灰色条，参考范围）*p≤0.05**p≤0.01，***p≤0.001。
图5
图5。再生骨髓生成过程中GMP簇形成的BM生态位控制
一，ELISA法测定5-FU处理的WT小鼠骨髓液中的细胞因子。b条，代表性的IF染色显示5-FU处理的BM中的血管系统（蓝色，放大的插入物中为黄色的假彩色）和血管渗漏（绿色，龙绿（DG）微球扩散试验）。c（c）代表性IF染色显示5-FU治疗的BM中的GMP（紫色），在第1-4天每天注射或不注射G-CSF（+G）。d日，GMP的代表性IF染色（紫色）Il1r1号机组+/+和Il1r1号机组−/−5-FU处理的BM，或IL-1β注射WT小鼠的BM。e（电子），代表性IF染色显示CD150+5-FU和G-CSF处理的WT-BM中的巨核细胞（红色）。f–h，注射白喉毒素（DT）的巨核细胞耗竭研究iDtr公司（Ctrl）和Cxcl4乘员：iDtr(Cre公司)小鼠和非注射性Ctrl小鼠[（−）DT]：（f）5-FU处理的骨髓中GMP（紫色）的实验方案和代表性IF染色，（g）d10和d12时骨髓液中ELISA细胞因子测量，以及（h）d12时HSC细胞周期分布（n=3）。星号表示pGMP和虚线cGMP。结果表示为平均值±S.D.（灰色条，参考范围）*p≤0.05**p≤0.01，***p≤0.001。
图6
图6。白血病骨髓细胞生成中连续GMP簇的形成
一，再生骨髓生成模型。EC：内皮细胞；MSC：间充质干细胞；Meg：巨核细胞；Comm.：承诺；SR：自我更新；差异：差异。红色表示激活，绿色表示抑制。b条，ELISA细胞因子测定在患病的BA、jB和相应的Ctrl小鼠的骨髓液中。c（c），代表性IF染色显示CD150+BA、jB和相应的Ctrl-BM中的巨核细胞（红色）、血管系统（蓝色，放大后的插入物中的假黄色）和血管渗漏（绿色，DG微球扩散试验）。d日，GMP（紫色）5-FU处理的Ctrl和BA BM的代表性IF染色。e（电子），白血病骨髓生成模型。LSC：白血病起始干细胞。星形表示pGMP，虚线表示cGMP。结果表示为平均值±S.D*p≤0.05。
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