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.2017年3月27日：6:e23249。
doi:10.7554/eLife.23249。

组蛋白基因替换揭示H3K36在维持后生动物转录组保真度中的转录后作用

迈克尔·P·米尔斯 1 2, Telmo Henriques公司 三, 克里斯托弗·A·薰衣草 4, 丹尼尔·麦凯 1 2 5 6, 布莱恩·德·斯特拉尔 7 8, 罗伯特·杜罗尼奥 1 2 5 6 8, 凯伦·阿德尔曼 三, 格雷戈里·马特拉 1 2 5 6 8
附属公司

组蛋白基因替换揭示H3K36在维持后生动物转录组保真度中的转录后作用

迈克尔·P·米尔斯等。 埃利夫. .

摘要

组蛋白H3赖氨酸36甲基化（H3K36me）被认为参与了许多共转录调控事件。为了研究这种不依赖于修饰它的酶的残基的功能，我们在果蝇属生成不可修饰的H3K36赖氨酸-精氨酸（H3K36R）突变体。我们观察到H3K36R动物中mRNA水平的全球失调，这与H3K365me3的发病率相关。与之前的研究类似，我们发现H3K36突变也会导致H4超乙酰化。然而，与之前报道的H3K36me的作用相比，无论是隐性转录起始还是选择性前mRNA剪接都没有对观察到的表达变化做出贡献。有趣的是，RNA监视核酸酶Xrn1和CCR4-Not-deadenylase复合体成员的敲除，恢复了一类下调的富H3K36me3基因的mRNA水平。我们提出了复制依赖型H3K36在控制后生动物基因表达中的转录后修饰作用。

关键词：D.黑腹滨鹬；RNA；染色体；表观遗传学；进化生物学；基因；基因组学；拼接。

PubMed免责声明

利益冲突声明

KA：审查编辑，电子生活.

其他作者声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.查询H3K36R动物转录组生命周期的策略。
(A类)H3K36R动物实验高通量测序方法示意图。将组蛋白重复单元的12个串联拷贝克隆到自定义BAC载体中，并将其位点特异性整合到D.黑腹果蝇基因组如McKay等人（2015）所述。从整个三龄幼虫中测序Poly-A-selected RNA，从三龄幼虫分离的细胞核中进行ATAC-seq和rRNA-depleted nuclear RNA-seq，从细胞核中选择短的、新生的、带帽的RNA，并进行“Start-seq”（Henriques等人，2013）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.003
图2。
图2 H3K36R突变体中的转录体失调与H3K365me3 ChIP-seq相关。
(A类)与HWT对照相比，H3K36R突变体中上调（紫色）、不变（蓝色）或下调（黄色）基因的H3K365me3（顶部）、H3K360e2（中部）和H3K36.me1（底部）ChIP-seq的后基因图。(B)基因队列差异表达的箱线图，按3'UTR中H3K36me3信号的密度分层（1=最低密度十分位，10=最高十分位）。(C类)MA图和伴随的LOESS回归线绘制了从poly-A RNA-seq数据解释的对数2倍变化（y轴）与HWT FPKM（x轴）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.004
图2——图补充1。
图2-图补充1.H3K36R突变体的基因表达变化。
(A类)描述起始位点位于Kharchenko等人2011年定义的九种不同染色质状态中的每一种的基因对数2倍表达变化的箱线图。(B)K36R动物中显著上调（蓝色）或下调（红色）基因的平均FPKM直方图（p<0.05）。(C类)左：HWT和K36R之间五个三龄幼虫的估计细胞含量的比较箱线图，基于定量RNA（左）或组蛋白H3 western blot信号的带强度标准化（右）。考虑到基于组蛋白归一化的K36R幼虫的细胞含量预计较高，K36R中每个细胞的总RNA可能被高估，因此基于K36R每个细胞较高RNA的偏差，对数2倍变化的基因表达值预计不会被高估。右：这一解释通过组蛋白与RNA-正常化RT-qPCR中选择的差异表达基因的低对数2倍表达变化得到证实。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.005
图3。
图3.突变体中H4乙酰化富集不会导致基因表达中的开放染色质依赖性变化。
(A类)蛋白质印迹法测量H3K36R突变体和HWT对照中组蛋白H3、H3K365me3、H3G27me3和泛H4乙酰化（H4ac）的富集。相对于第一条车道的信号在每个频带下方表示。(B)obsTSS周围200 nt窗口（如顶部所示）中ATAC-seq信号映射的散点图，R2指示值。(C类)poly-A RNA-seq（x轴）与ATAC-seq（y轴）信号在相应基因转录起始位点周围窗口中对数2倍变化的散点图（由start-seq确定）。在RNA-seq和ATAC-seq中具有共向、统计显著变化的基因用红色表示。在其起始位点染色质可及性没有变化的情况下，突变体中差异表达的基因的浏览器截图示例如右图所示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.006
图3——图补充1。
图3补充1。H3K36R动物组蛋白串扰和基因表达变化。
(A类)显示western-blot信号强度的折叠变化的条形图，该信号强度由两个生物复制的全部幼虫核裂解物定量，用于显示抗体。星号表示H3和所示PTM之间的T检验p值<0.05。(B)归一化poly-A RNA-seq的箱线图计算了HWT和K36R中与强多梳调控区共存的基因的映射（Schwartz等人，2006年）。(C类)HWT和K36R三龄幼虫唾液腺多线体染色体压片和H4K12ac免疫荧光染色。H4K12ac-bright（黄色箭头）和转录沉默的DAPI bright（橙色箭头）区域在这两种基因型中都是反相关的，表明H4K12ac在K36R突变体中积累到转录活性区域D）基因队列差异表达的箱线图，该差异表达由注释基因起始位点周围400 nt窗口中的H4K16ac ChIP-seq信号密度分层（1=最低密度十分位，10=最高十分位）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.007
图3——图补充2。
图3补充图2。在先前注释（观察到的）转录起始位点obsTSS处Start-seq读取的元基因分析。
(A类)Start-seq信号的Metaplot在dm3参考基因模型中所有注释的TSS周围的100 nt窗口中对齐。(B)HWT和K36R核RNA-seq信号的Metaplot在Start-seq数据中确定的所有obsTSS周围的1 kb窗口中对齐。(C类)注释基因启动子（obsTSS）处Start-seq信号堆积的代表性浏览器截图。箭头表示的转录方向。(D类)围绕Start-seq识别的obsTSS的4kb窗口中ATAC-seq信号的Metaplot。obsTSS由窗口中的平均归一化信号进行装箱（在图例中表示）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.008
图4。
图4.H3K36修饰不抑制编码区中的隐秘转录起始。
(A类)包含新的未标记转录起始位点（nuTSS，以红色突出显示）的基因的代表性浏览器快照。转录方向用箭头表示，读取计数用Y轴表示。(B)描述nuTSS Start-seq信号折叠变化的箱线图，根据其基因组定位和相对于常驻基因的起源链进行分类（如适用）。下箱线图描述了相同基因队列的H3K36me3 ChIP-seq信号（ChIP/input）。(C类)归一化核RNA-seq散点图显示了HWT（x轴）或K36R（y轴）dm3参考基因模型中反义基因的映射。包含或位于局部H3K36me3-ChIP-seq峰1 kb以内的基因用红点表示。(D类)Hex-plot heatmap通过nuTSS相对于最近基因的基因边界的位置以及其Start-seq信号的绝对变化（K36R–HWT）绘制nuTSS。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.009
图4——图补充1。
图4补充1。与开放染色质、核小体定位和H3K36三甲基化相比，Start-seq在新的、未标记（nu）TSS中读取的后基因分析。
(A类)在nuTSS周围1 kb窗口中的ATAC-seq信号映射的元图，分类如图4B所示。(B)H3（左）和H3K36me3（右）ChIP-seq信号的Metaplots映射到nuTSS周围的4kb窗口，由K36R和HWT之间的绝对Start-seq变化的四分位数隔开。(C类)HWT ATAC-seq信号的Metaplots映射到nuTSS周围的4kb窗口，由Start-seq信号的对数倍变化分隔。”在K36R中，“Up”表示增加了两倍以上，“Down”表示减少了两倍以上，“Unchanged”表示所有其他nuTSS。(D类)热图显示H3（左）和H3K36me3（右）ChIP-seq信号映射到nuTSS周围的4kb窗口，表示B中列出的类别(E类)热图显示H3（左）和H3K36me3（右）ChIP-seq信号映射到nuTSS周围的4kb窗口，表示C中列出的类别。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.010
图5。
图5.H3K36修改未规定替代拼接。
(A类)密度图反映了根据MISO参数手动分类为显著的跳过外显子（红色）或保留内含子（蓝色）选择性剪接事件的剪接百分比（∆PSI）值变化分布（见材料和方法）。(B)跳过外显子（左）和保留内含子（右）事件的火山图，局部回归线（蓝线）反映了基于贝叶斯因子（y轴）的∆PSI值（x轴）的偏差。(C类)拼接接头使用的全局分析，其中R表示一种情况下的“保留率”，∆R表示K36R和HWT之间的R差异。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.011
图6。
图6 H3K36R突变体中的一类高表达基因受到核酸外切酶降解和低效转录后处理的影响。
(A类)从核或多-A RNA-seq的MA图生成的LOESS回归线，绘制基因对数2倍变化（y轴）与HWT的标准化读取计数（x轴）。(B)核（左）和聚A（右）RNA-seq中K36R和HWT之间的对数倍变化值，绘制用于进一步RT-PCR分析的基因。(C类)RT-qPCR量化无RNAi中选择基因的HWT和K36R之间的差异表达，帕克曼RNA干扰，成双的RNAi，或流行音乐2RNAi背景，使用-∆∆Ct吨方法。(D类)HWT和K36R中YFP转录物的LM-PAT分析结果，无RNAi，多氯联苯RNA干扰，成双的RNAi，或流行音乐2RNAi背景。桑格测序追踪证实了poly-A位点（最左侧面板）和差异尾部长度（右侧两个面板），如下所示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.012
图6——图补充1。
图6补充了图1。RT-PCR对照、选择性聚腺苷酸化分析和显示引物相对位置的基因特异性聚A尾部长度分析（LM-PAT）的分析示意图。
(A类)RT-PCR用于从HWT（1和3道）或K36R（2和4道）动物的细胞质（1和2道）或核（3、4道）RNA中选择基因。7SK RNA是核浓缩的控制物。(B)图6B中选择基因的RT-qPCR，测量无RNAi或Dcp2型RNAi背景。通过t检验获得的P值。(C类)修饰的LM-PAT测定的示意图，其中将腺苷酸寡核苷酸锚连接到总RNA的3’端，使用锚特异性RT引物产生cDNA，使用基因特异性正向引物和锚定特异性反向引物扩增感兴趣的基因，该引物在其3'端包含寡核苷酸-T序列（尾锚定），以便从多聚a末端延伸，或寡核苷酸-T-N序列（UTR-锚定）以便从3'UTR末端延伸。(D类)YFP的RT-qPCR测量无RNAi条件下的标准化对数2倍变化（HWT/K36R），多氯联苯RNAi，或成双的RNAi背景。通过t检验获得的P值。(E类)使用DaPars对选择性多聚腺苷化进行全基因组分析（Xia等人，2014），HWT和K36R中每个基因的远端poly-A位点使用率（PDUI）分别绘制在x轴和y轴上。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.013
作者回复图片1。
作者回复图片1。
内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.018
作者回复图片2。
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内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23249.019
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