Abnormal Neural Progenitor Cells Differentiated from Induced Pluripotent Stem Cells Partially Mimicked Development of TSC2 Neurological Abnormalities

doi:10.1016/j.stemcr.2017.02.020

.2017年4月11日；8(4):883-893.

doi:10.1016/j.stemcr.2017.02.020。 Epub 2017年3月23日。

从诱导的多能干细胞分化出的异常神经前体细胞部分模拟TSC2神经异常的发展

李亚琴¹, 曹吉庆², 陈梦龙^三, 李静（音译）^三, 孙一鸣^三, 于章^三, 朱玉玲^三, 王亮（Liang Wang）^三, 张成⁴

附属公司

¹中山大学第一附属医院神经内科，广东广州510080；中山大学附属第七医院神经内科，广东省深圳市，邮编518017。
²中山大学第一附属医院神经内科，广东广州510080；华中科技大学同济医学院武汉市中心医院神经内科，中国武汉430014。
^三中华人民共和国广东省广州市中山大学第一附属医院神经内科，邮编510080。
⁴中华人民共和国广东省广州市中山大学第一附属医院神经内科，邮编510080。电子地址：zhangch6@mail.sysu.edu.cn。

PMID： 28344003
预防性维修识别码： PMC5390135型
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.02.020

从诱导的多能干细胞分化出的异常神经前体细胞部分模拟TSC2神经异常的发展

李亚琴等。干细胞报告. 2017.

.2017年4月11日；8(4):883-893.

doi:10.1016/j.stemcr.2017.02.020。 Epub 2017年3月23日。

作者

李亚琴¹, 曹吉庆², 陈梦龙^三, 李静（音译）^三, 孙一鸣^三, 于章^三, 朱玉玲^三, 王亮（Liang Wang）^三, 张成⁴

附属公司

¹中山大学第一附属医院神经内科，广东广州510080；中华人民共和国广东省深圳市中山大学第七附属医院神经内科，邮编：518017。
²中山大学第一附属医院神经内科，广东广州510080；华中科技大学同济医学院武汉市中心医院神经内科，中国武汉430014。
^三中华人民共和国广东省广州市中山大学第一附属医院神经内科，邮编510080。
⁴中华人民共和国广东省广州市中山大学第一附属医院神经内科，邮编510080。电子地址：zhangch6@mail.sysu.edu.cn。

PMID： 28344003
预防性维修识别码： PMC5390135型
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.02.020

摘要

结节性硬化综合征（TSC）是一种具有破坏性和治疗挑战性的神经异常疾病。然而，TSC缺乏特定的神经前体细胞模型。在这里，使用来自TSC2中c.1444-2A>c突变患者的原始神经干细胞（pNSC）研究TSC的病理学。我们发现，与对照pNSC相比，TSC2 pNSC具有更高的增殖活性，PAX6表达增加。从TSC2 pNSC分化出来的神经元表现为胞体扩大，突起生长受到干扰，细胞间连接异常。TSC2星形胶质细胞饱和密度增加，增殖活性增强。此外，mTOR通路的活性在pNSC中增强，并在神经元和星形胶质细胞中诱导。因此，我们的结果表明TSC2杂合性导致pNSC的神经畸形，表明其杂合性可能足以导致患者的神经畸形。

关键词：诱导多能干细胞；mTOR；神经分化；神经异常；原始神经干细胞；结节性硬化综合征。

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数字

图1
结节性硬化综合征患者的临床特征（A）患者家族谱系。（B）体格检查显示面部血管纤维瘤、白色斑点和枕部白斑。（C）脑MRI显示侧脑室室管膜下结节。（D）的排序*TSC2系统*TSC患者中发现c.1444-2A>c突变。

图2
从TSC患者中诱导多能干细胞的生成和鉴定（A）从外周血单个核细胞生成iPSC的实验方案。（B） iPSC细胞系在无饲养基中的形态。比例尺，100μm。（C） iPSC系中多能性标记OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-81的免疫荧光。比例尺，100μm。（D） iPSC系内胚层（α-甲胎蛋白[AFP]）、中胚层（平滑肌肌动蛋白[SMA]）和外胚层（NESTIN）标记物的免疫荧光。比例尺，50μm。（E） TSC患者衍生iPSC系的畸胎瘤形成显示了来自三个胚层的组织。比例尺，100μm。（F） iPSC系的核型分析。另请参见图S1–S3。

图3
从患者特异性iPSCs中衍生和激活原始神经干细胞（A）TSC和对照pNSC的相显微照片。比例尺，100μm。（B）从TSC患者、正常对照组和雷帕霉素处理的iPSCs分化的pNSC的免疫荧光，显示标记物NESTIN、SOX1、PAX6和SOX2的表达。比例尺，100μm。（C和D）使用神经干细胞标记物NESTIN、SOX1和PAX6对TSC患者、正常对照组和雷帕霉素处理的iPSC的pNSC进行流式细胞术分析（n=3个独立实验，平均值±SEM；^***p＜0.005；学生t测试）。比例尺，100μm。

图4
TSC单倍体低效率pNSCs（A）CCK8检测中的高增殖率和mTOR通路激活*TSC公司*用或不用雷帕霉素处理24、48和72小时的单倍体充足和正常对照pNSC。在24、48、72和96小时检测吸光度（n=3个独立实验，平均值±SEM）。（B和C）BrdU染色（n=3个独立实验，平均值±SEM；^***p<0.005，^∗∗∗∗p<0.001；学生t测试）。比例尺，100μm。（D和E）TSC pNSC中S6磷酸化增加。（n=3-4个独立实验，平均值±SEM；^∗∗∗∗p<0.001；学生t测试）。比例尺，100μm。（F）通过western blot分析评估pNSC中mTOR通路的激活。表达水平归一化为3-磷酸甘油醛（GAPDH）（n=3个独立实验，平均值±SEM；^***p<0.005；学生t测试）。另请参见图S4。

图5
TSC pNSC分化为神经元（A–G）的免疫荧光图像（A），显示TSC患者和未受影响的对照组分化的神经元的β-III-TUBULIN表达以及TSC患者与未受影响对照组分化出的神经元的形态，如神经生物学J（B–G；n=3个独立实验，平均值±SEM；^***p<0.005，^***p<0.001；学生t测试）。比例尺，20μm。（H） S6磷酸化增加*TSC公司*神经元。比例尺，100μm。另请参见图S5。

图6
TSC星形胶质细胞的高增殖率和mTOR通路激活（A）TSC和对照星形胶质细胞在第1、7、14和21天的相位显微照片。TSC和对照星形胶质细胞的（B和C）BrdU染色（n=3个独立实验，平均值±SEM；^∗∗∗∗p<0.001；学生t测试）。比例尺，100μm。（D和E）TSC星形胶质细胞S6磷酸化增加（n=3个独立实验，平均值±SEM；^∗p<0.05；学生t检验）。比例尺，100μm。

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