PAMAM Dendrimers Cross the Blood-Brain Barrier When Administered through the Carotid Artery in C57BL/6J Mice

doi:10.3390/ijms18030628

.2017年3月14日；18(3):628.

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PAMAM树突状物经颈动脉给药跨越C57BL/6J小鼠血脑屏障

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¹美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。srina1b@cmich.edu。
²美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编48859。srina1b@cmich.edu。
^三美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。peruz1st@cmich.edu。
⁴美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编48859。peruz1st@cmich.edu。
⁵美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。andre2mm@cmich.edu。
⁶美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编：48859。andre2mm@cmich.edu。
⁷美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。johns52k@cmich.edu。
⁸美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。hietp1ar@cmich.edu。
⁹美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。clark6bm@cmich.edu。
¹⁰美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。mcgui4c@cmich.edu。
¹¹美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编：48859。mcgui4c@cmich.edu。
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¹³美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。kippe1jm@cmich.edu。
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¹⁵美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。stewa2an@cmich.edu。
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¹⁸美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编48859。lossi1ov@cmich.edu。
¹⁹美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学医学院，邮编48859。lossi1ov@cmich.edu。
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²⁴美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学医学院，邮编48859。antcl1ak@cmich.edu。
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²⁶美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编：48859。culve1rl@cmich.edu。
²⁷美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。swans1d@cmich.edu。
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³¹美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学心理学系48859。dunba1g@cmich.edu。
³²美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。sharm1a@cmich.edu。
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PAMAM树突状物经颈动脉给药跨越C57BL/6J小鼠血脑屏障

Bhairavi Srinageshwar公司等。国际分子科学杂志. 2017.

.2017年3月14日；18(3):628.

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¹美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学恢复神经学领域神经科学研究所实验室，邮编48859。srina1b@cmich.edu。
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⁴美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编：48859。peruz1st@cmich.edu。
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⁶美国密歇根州普莱森特山中密歇根大学神经科学项目，邮编48859。andre2mm@cmich.edu。
⁷美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。johns52k@cmich.edu。
⁸美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。hietp1ar@cmich.edu。
⁹美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。clark6bm@cmich.edu。
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²⁷美国密歇根州中部大学化学与生物化学系，Mount Pleasant，MI 48859。swans1d@cmich.edu。
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摘要

由于血脑屏障（BBB）的存在，药物输送到中枢神经系统（CNS）具有挑战性，而克服血脑屏障的药物输送到大脑可以使用树状大分子等纳米颗粒来实现。使用的传统阳离子树枝状大分子毒性很高。因此，本研究调查了新型混合表面树状大分子的作用，这种树状大细胞具有潜在的低毒性，并且当通过小鼠颈动脉给药时可以穿过血脑屏障。体外实验研究了胺树枝状大分子（G1-NH）的摄取二氧化碳和G4-NH₂) 以及通过初级皮层培养获得的新型树状大分子（G1-90/10和G4-90/10）。体内实验包括通过（1）侵入性颅内注射纹状体将G4-90/10移植到小鼠体内；低侵袭性颈动脉注射。移植后24小时和1周处死动物，并对其大脑进行分析。体内实验证明，G4-90/10经颈动脉注射后可以穿过BBB，并定位于神经元和胶质细胞内。在颅内注射1周后，发现树状大分子通过胼胝体迁移。免疫组织化学显示迁移细胞为树枝状大分子感染的神经胶质细胞。总的来说，我们的结果表明，聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子可作为一种微创手段，用于输送生物分子治疗神经疾病或障碍。

关键词：PAMAM树状大分子纳米粒子；生物分布和吸收；血脑屏障；神经退行性疾病；无创输送。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
(A类)G1-90/10树枝状聚合物，90%的表面覆盖OH（中性）基团，10%的表面覆盖NH₂（阳离子）基团；(B类)G4-90/10树状大分子，90%的表面覆盖OH（中性）基团，10%的表面覆盖NH₂（阳离子）基团。

图2
树枝状大分子的酸性凝胶电泳。**车道1**代表未标记的G4-90/10；**2号车道**代表G490/10与添加的50%摩尔异硫氰酸荧光素（FITC）反应，与树枝状大分子中胺基的摩尔数相比(2楼);**3号车道**代表G4-90/10与添加的100%mol FITC反应，与树枝状大分子中胺基的mol相比(**第三层**). 由于二者的强度没有太大差异，我们决定使用车道2中制备的树枝状聚合物，以避免通过添加更多FITC降低共轭物的水溶性。

图3
树枝状大分子的反相高效液相色谱（RP-HPLC）：G4-90/10表面的保留时间为10.1min，蛋清溶菌酶的保留时间是18min。

图4
G4-90/10树枝状大分子的等电聚焦（IEF）。凝胶的上半部分是酸性的，下半部分是碱性的。通道1和通道2为溶菌酶（pI 11.0）；通道3是淀粉葡萄糖苷酶（pI3.5；蛋白质几乎没有进入凝胶）；车道4为肌红蛋白（pI6.8），车道5为核糖核酸酶A（pI9.5），通道6为细胞色素c（pI10.7）；车道7和车道8为G4-90/10树枝状大分子。

图5
共聚焦图像显示细胞摄取(A类)G1-NH（G1-NH）₂; (B类)G1-90/10；(C类)G4-羟基₂; 和(D类)G4-90/10树状大分子通过初级皮层培养（神经元和胶质细胞）。观察到细胞染色（红色）和FITC标记的树枝状大分子（绿色）之间的共定标。神经元的过程也能够摄取树状大分子（箭头；A类–D类). 所有图像均使用奥林巴斯BX50立式显微镜（日本东京新宿奥林巴斯）在60倍（2.5倍放大）放大率下拍摄。比例尺：20μm。

图6
通过颈动脉注射时大脑中树状大分子的共焦图像。碘化丙啶（PI）染色标记的神经元和胶质细胞（红色-A类,D类,**G公司**)Hank的平衡盐溶液（HBSS）控制和合并(B类,C类)，G4-90/10感染细胞（箭头；E类)和合并（箭头；F类)，G4-90/10围绕血管（箭头；**H（H）**)和合并（箭头；我). 使用奥林巴斯BX50立式显微镜（日本东京新宿奥林巴斯）在40倍放大率下拍摄所有图像。比例尺：100µm。

图7
大脑内注射树状大分子时的共焦图像。用碘化丙啶染色（红色）标记神经元和胶质细胞-A类,D类)、HBSS控制和合并(B类,C类)，G4-90/10感染细胞（箭头；E类)和合并（箭头；F类). 使用奥林巴斯BX50立式显微镜（日本东京新宿奥林巴斯）在40倍放大率下拍摄所有图像。比例尺：100μm。

图8
针道周围G4-90/10树状大分子的共焦图像（箭头指向该区域）。使用奥林巴斯BX50立式显微镜（日本东京新宿奥林巴斯）以40倍放大率拍摄图像。比例尺：100µm。

图9
G4-90/10树状大分子通过胼胝体跨半球迁移的图像（箭头所示），颅内移植1周后进入纹状体。使用蔡司观察家倒置显微镜（Zeiss，Oberkochen，德国）以10倍放大率拍摄图像，比例尺：100μm。

**图10**
(A类)细胞核NeuN抗体染色（红色）；(B类)颅内移植后1周皮层神经元对G4-90/10树枝状大分子的摄取；(C类)NeuN和树状大分子之间的共定标显示神经元对树状大蛋白的摄取；(D类–F类)显示的缩放图像(A类–C类)分别是。箭头在D类显示神经元表达NeuN；箭头在E类显示神经元对G4-90/10树状大分子的摄取F类显示了树状大分子和NeuN染色之间的共定位，证实了神经元对树状大细胞的摄取。图像(**顶部面板**)使用蔡司观察家倒置显微镜（Zeiss，Oberkochen，德国）在20倍放大率下拍摄。比例尺：100μm。

**图11**
(A类)胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体染色的胶质细胞（红色；见箭头）；(B类)胶质细胞尤其是胼胝体在颅内移植后1周内对G4-90/10树状大分子的摄取（箭头所示）；(C类)GFAP和树状大分子之间的共定标显示胶质细胞对树状大细胞的摄取（箭头所示）；(D类–F类)显示的缩放图像(A类–C类)分别位于胼胝体区。箭头在D类显示胶质细胞表达GFAP；箭头inE类显示胶质细胞对G4-90/10树状大分子的摄取F类显示了树状大分子和GFAP染色之间的共定位，证实了胶质细胞对树状大细胞的摄取。这证明迁移细胞是占据树状大分子的胶质细胞。图像(**顶部面板**)使用蔡司观察家倒置显微镜（Zeiss，Oberkochen，德国）在20倍放大率下拍摄。比例尺：100μm。

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