ICF-specific DNMT3B dysfunction interferes with intragenic regulation of mRNA transcription and alternative splicing

doi:10.1093/nar/gkx163

.2017年6月2日；45(10):5739-5756.

doi:10.1093/nar/gkx163。

ICF-特异性DNMT3B功能障碍干扰mRNA转录和选择性剪接的基因内调节

附属公司

¹意大利那不勒斯80131，CNR，遗传和生物物理研究所“Adriano Buzzati-Traverso”。
²Sanford Burnham Prebys医学发现研究所，美国加利福尼亚州拉霍拉。
^三应用数学研究所“Mauro Picone”，CNR，那不勒斯80131，意大利。
⁴意大利卡塞塔81100，那不勒斯第二大学环境、生物和制药科学与技术系。
⁵CNRS UMR7216，表观遗传学和细胞命运，巴黎迪德罗大学，巴黎索邦大学，巴黎城，法国75205。
⁶以色列海法Technion Rambam Health Care Campus和Rappaport医学院分子医学实验室。
⁷IRCCS Neuromed，意大利波兹利。

PMID： 28334849
预防性维修识别码：项目编号：5449610
内政部： 10.1093/nar/gkx163

ICF-特异性DNMT3B功能障碍干扰mRNA转录和选择性剪接的基因内调节

唯一的大门等。核酸研究. 2017.

.2017年6月2日；45(10):5739-5756.

doi:10.1093/nar/gkx163。

附属公司

¹意大利那不勒斯80131，CNR，遗传和生物物理研究所“Adriano Buzzati-Traverso”。
²Sanford Burnham Prebys医学发现研究所，美国加利福尼亚州拉霍拉。
^三应用数学研究所“Mauro Picone”，CNR，那不勒斯80131，意大利。
⁴意大利卡塞塔81100，那不勒斯第二大学环境、生物和制药科学与技术系。
⁵CNRS UMR7216，表观遗传学和细胞命运，巴黎迪德罗大学，巴黎索邦大学，巴黎城，法国75205。
⁶以色列海法Technion Rambam Health Care Campus和Rappaport医学院分子医学实验室。
⁷IRCCS Neuromed，意大利波兹利。

PMID： 28334849
预防性维修识别码：项目编号：5449610
内政部： 10.1093/nar/gkx163

摘要

DNA-甲基转移酶DNMT3B的低形态突变导致大多数罕见的疾病免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常综合征（ICF1）。通过未明确的机制，突变的DNMT3B干扰淋巴特异性通路，导致免疫反应缺陷。有趣的是，最近的研究发现DNMT3B形成了高转录基因的基因内CpG甲基化。然而，DNMT3B依赖的表观遗传网络如何调节转录，以及ICF1特异性突变是否损害这一过程尚不清楚。我们在患者来源的B细胞系中进行了转录组和表观基因组研究，以研究DNMT3B功能障碍的基因组规模效应。我们强调，基因内CpG-甲基化改变会损害转录调控的多个方面，如TSS的替代使用、反义转录和外显子剪接。这些缺陷优先与基因内H3K4me3的变化相关，在较小程度上与H3K27me3和H3K36me3相关。此外，我们强调了一种新的DNMT3B活性，通过与RNA分子相互作用，调节有义反义对的自我调节回路和选择性剪接过程中的外显子跳跃。引人注目的是，转录改变影响疾病相关基因，例如记忆B细胞标记CD27和PTPRC基因，为我们提供了ICF1综合征发病机制的生物学见解。我们的基因组尺度方法揭示了DNMT3B基因内功能和DNA甲基化在基因表达调控中的机制，但这些机制目前仍不清楚。

©作者2017。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
ICF1特异性DNMT3B突变细胞中CpG甲基化、基因表达、DNMT3B和组蛋白标记（H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）的全基因组分析。(A类)所有常染色体DNA甲基化数据（RRBS）的散点图和密度色码。显示了对照组（Ctrls）之间以及ICF1p1或ICF1p2与平均Ctrls之间甲基化百分比的成对比较；(B类)使用Homer工具（85）计算的DNMT3B峰（上面板）和亚高-DMR（Δ≥|25%|；下面板）沿基因特征（启动子、5UTR、外显子、内含子、3UTR和TTS）的分布；(C类)差异表达亚型相关基因（DE-isoforms）中的丰富基因通路（IPA）(*P（P）*-考虑了BH法修正的值）；(天)显示受DNA甲基化变化影响的DE-isoforms相关基因百分比的饼图(*P（P）*-值<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）；(E类)H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3（每百万映射读取的读取计数）在次-DMR和超-DMR（上游-2kb，下游+2kb）的密度图。

**图2。**
DNMT3B功能障碍影响ICF1细胞中TSS异构体的使用和来自隐秘TSS的转录。(A类)通过整合RNA-Seq、WGBS和ChIP-Seq数据集获得的饼图显示了差异表达的TSS异构体百分比（±500 bp），其中至少有五个CpG差异甲基化和/或H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3标记发生变化(*P（P）*-值<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）；(B类)UCSC基因组浏览器屏幕截图*TCEA2公司*在相应的TSS中显示差异表达的长转录和短转录亚型、CpG甲基化状态和H3K4me3富集的基因。每个实验中ICF1和对照样品的垂直观察范围设置相同；(C类)长亚型和短亚型mRNA水平（qPCR）*TCEA2公司*轨迹和(天)CpG甲基化水平[log₂（甲基化/非甲基化）]*TCEA2公司*与对照组相比，ICF1样品中的长异构体TSS；(E类)饼图显示了差异表达的隐秘TSS（CAGE-tag，Pol II结合位点，H3K4me3峰±500 bp）的百分比，其中至少有五个CpG差异甲基化和/或组蛋白标记发生变化(*P（P）*-值<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）；(F类)UCSC基因组浏览器截图，代表一个神秘的TSS（Pol II结合位点；UCSC登录：wgEncodeEH001426）*NEURL（新网址）*与CpG低甲基化、H3K4me3增加和转录上调相关的基因，如WGBS、RNA-Seq、H3K4me3和H3K36me3 ChIP-Seq所示；(**G公司**)的表达式级别*NEURL（新网址）*隐秘的TSS和(**H（H）**)与对照组相比，ICF1样品中的CpG甲基化[log2（甲基化/非甲基化）]。使用χ²-测试**P（P）*-调整值<0.05***P（P）*-调整<0.005****P（P）*-调整<0.0005。

**图3。**
DNMT3B功能障碍影响ICF1细胞中正反义对基因的转录。(A类)饼图显示了通过整合RNA-Seq、WGBS和ChIP-Seq数据集获得的差异表达的天然反义转录物百分比（±500 bp），其中至少有5个CpG差异甲基化和/或H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3标记发生变化(*P（P）*-值<<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）；(B类)DNA甲基化和H3K4me3、H3K27me3及H3K36me3变化显著丰富了与解除调控的NAT相关的差异表达的正义基因(*P（P）*-值<<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）。使用χ²-测试；(C类)UCSC基因组浏览器截图*CD27型*显示有义转录物异常沉默和反义转录物伴随过度表达的基因*CD27-AS1型*（RNA-Seq）、CpG甲基化状态（WGBS）以及H3K4me3和H3K36me3富集（ChIP-Seq）；(天)mRNA，以及(E类)CpG甲基化水平[log₂（甲基化/非甲基化）]*CD27型*感觉基因；(F类)mRNA水平*CD27-AS1型*与对照组相比，ICF1样本中的反义（使用基因特异性引物专门检测反义转录物；补充表S1）；(**G公司**)H3K4me3富集（ChIP-qPCR）*CD27型*和*CD27-AS1*TSS；(**H（H）**)DNMT3B和DNMT3A富集至*CD27型*TSS感测区（ChIP-qPCR）；(我)DNMT3B和DNMT3A与*CD27-AS1型*反义转录物和*CD27型*感觉和*ACTB公司*转录物作为阴性对照（RIP-qPCR）；(J型)箱线图显示了正义基因在TSS的甲基化水平，与反义伴侣相比，其表达降低（反义/正义比≥1.5 FPKM），并与DNMT3B在转录水平上相互作用，与每个细胞系中的免疫沉淀（DNMT3B-相互作用转录物）和未结合RNA部分相比较**P（P）*-调整值<0.05***P（P）*-调整<0.005****P（P）*-调整<0.0005。

**图4。**
DNMT3B功能障碍影响ICF1细胞的选择性外显子剪接。(A类)饼图显示了具有不同甲基化CpGs和/或H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3标记变化的差异拼接外显子部分的百分比（使用单尾超几何检验进行统计分析，表明差异包含外显子的这些表观遗传修饰没有显著富集）；(B类)显示差异剪接外显子的基因与DNMT3B与其转录物结合减少或增加的基因之间重叠的维恩图（RIP-Seq）(*P（P）*-值<<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）；(C类)直方图显示具有差异剪接外显子和与转录物结合的DNMT3B增加的基因数量（归一化为IgG分数；RIP-Seq）。DNMT3B结合的获得与外显子的跳过或包含显著相关(*P（P）*-值<<10⁻¹⁶采用单尾超几何检验进行计算）；(天)UCSC基因组浏览器截图*PTPRC公司*(*CD45型*)显示外显子4-5-6跳跃（RNA-Seq）和CpG甲基化状态（WGBS）的基因；(E类)半定量PCR扩增*CD45型*对照组和ICF1样本中的剪接异构体。使用的底漆为F和R，如D所示；(F类)的表达水平（qPCR）*CD45RABC基因*使用异构体特异性寡核苷酸**P（P）*-调整值<0.05***P（P）*-调整<0.005****P（P）*-adj<0.0005。

**图5。**
DNMT3B通过与hnRNP-LL和*CD45型*前mRNA(A类)天然RNA免疫沉淀分析（RIP-qPCR）显示DNMT3B与*CD45型*对照组和ICF1样品中的前mRNA。绑定到*HOXC4型*mRNA报告为阴性对照；(B类)DNA（外显子4、5和6）处的DNMT3B富集*CD45型*ChIP法检测基因；(C类和天)的表达式级别*hnRNP-LL公司*分别用qPCR和western blot检测ICF1样品和对照；(E类)CpG甲基化水平[log2（甲基化/非甲基化）]*hnRNP-LL公司*ICF1样品中的启动子；(F类)如免疫共沉淀实验所示，DNMT3B和hnRNP-LL在ICF1p2样本中发生物理相互作用；(**G公司**)的表达水平（qPCR）*CD45RABC基因*和组成外显子9，在siDNMT3B上使用亚型特异性寡核苷酸并控制siRNAs转染；(**H（H）**)半定量PCR扩增*CD45型*siDNMT3B和对照siRNAs转染后过度表达的hnRNP-LL ICF1p2样本中的剪接亚型**P（P）*-调整值<0.05***P（P）*-调整<0.005****P（P）*-调整<0.0005。

**图6。**
显示ICF1特异性DNMT3B功能障碍在调节(A类)替代异构体-TSS的使用(B类)隐秘转录(C类)正反义基因自我调节回路和(天)选择性外显子剪接。

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