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.2017年3月28日；114（13）：E2758-E2765。
doi:10.1073/pnas.1611665114。 Epub 2017年3月14日。

受体Mincle促进皮肤过敏，能够识别硫酸胆固醇

阿列克谢·V·科斯塔诺伊 1, 佩蒂亚·甘切娃 2, 伯恩德·列彭尼斯 三, 阿米尔·图克瓦图林 4, Alina S Dzharullaeva公司 4, 尼基塔·波利亚科夫 5 6, 丹尼尔·格鲁莫夫 5, Daria A Egorova女士 2, 安德烈·库利宾 7, 马克西姆·博布罗夫 8, 叶卡捷琳娜·马洛丽娜 7 9, 帕维尔·A·兹金 10, 安德烈·索洛维耶夫 5, 叶夫根尼·里亚本科 11 12, 戴安娜·马尔采娃 13, 德米特里·A·萨哈罗夫 13, 亚历山大·托尼维斯基 14, 柳德米拉五世韦尔霍夫斯卡娅 15, 丹尼斯·洛古诺夫 4, 鲍里斯·纳罗迪茨基 2, 亚历山大·金茨堡 16
附属机构

受体Mincle促进皮肤过敏并能够识别硫酸胆固醇

阿列克谢·科斯塔诺伊等。 美国国家科学院程序. .

摘要

无菌（非感染性）炎症是许多广泛疾病的发病机制，如过敏和自身免疫性疾病。进化上保守的先天免疫系统被认为在组织损伤识别和无菌性炎症的后续发展中起着关键作用；然而，其潜在的分子机制尚不完全清楚。在此，我们表明，屏障组织上皮层中相对高浓度的硫酸胆固醇分子被Mincle（Clec4e）选择性识别，Mincle是先天免疫系统的C型凝集素受体，对皮肤损伤反应强烈上调。硫酸胆固醇激活小分泌物导致一系列促炎介质的分泌，皮下注射硫酸胆固醇导致小分泌素介导的严重局部炎症反应的诱导。此外，我们的研究揭示了Mincle作为驱动成分在过敏性皮肤炎症发病机制中的作用。在一个公认的过敏性接触性皮炎模型中，缺乏Mincle可显著抑制皮肤炎症反应的程度，通过耳廓厚度、髓细胞浸润、细胞因子和趋化因子分泌的变化进行评估。综上所述，我们的研究结果对无菌炎症的基本机制有了更深入的了解。

关键词：Mincle；过敏；硫酸胆固醇；先天免疫；无菌炎症。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Mincle（Clec4e）是皮肤中的一种PRR，对创伤反应具有高度诱导性，并介导早期炎症反应。(A类)全基因组微阵列分析小鼠皮肤对兴奋性损伤反应中固有免疫PRR基因表达的变化。这些基因按家族分类：TLRs、NLRs、CLRs和RLRs。文中给出了受伤皮肤转录水平相对于完整皮肤转录水平的折叠变化。PRR基因在至少一个时间点的绝对倍数变化>3.0，并调整FDRP（P）显示了低于0.05的值（Benjamini–Hochberg程序）。(B类)通过蛋白质印迹法评估受伤小鼠皮肤中Mincle蛋白水平变化的时间过程。(C类)通过Western blotting评估单次外用25μL 0.5%DNFB后小鼠皮肤中Mincle蛋白水平变化的时间进程，以及与载体应用后皮肤中Mincle蛋白水平的变化。(D类)通过免疫染色评估损伤或单次接触DNFB后完整皮肤和皮肤中Mincle的表达。显示皮肤受伤或DNFB暴露后2小时的时间点。所示为每组至少六只动物的皮肤切片的代表性结果。(E类)单次暴露于25μL 0.5%DNFB 2 h后，对小鼠皮肤的Mincle和树突状细胞标记进行荧光双重染色。显示了具有代表性的图像。(F类)皮肤损伤后，在缺乏Mincle的情况下，以及在单次局部应用25μL 0.5%DNFB后，促炎介质的分泌显著受损。在受伤或DNFB或载具暴露后12 h测量皮肤中的介质水平*P（P）<0.05与野生型（WT）(n个=每组5只小鼠；显示了三个独立实验之一的代表性结果）。显示平均值±SD。
图S1。
图S1。
Mincle-deficient小鼠和野生型小鼠的全层伤口闭合。(A类)不同愈合阶段伤口的代表性照片。(B类)不同时间点的伤口面积减少，以初始伤口大小的百分比表示。结果显示为平均值±SD(n个=每组5只小鼠；显示了两个独立实验之一的代表性结果）。
图2。
图2。
内源性Mincle配体的鉴定。(A类)使用从小鼠皮肤样品中分离的总脂质提取物或固相提取物（反相C18盒）中的洗脱液的连续稀释液刺激Mincle-表达（HEK293–mMincle-NF-κB–Luc）或对照（HEK2903–NF-κB-Luc）报告细胞系。使用TDB（2µg/mL）和TNFa（100 ng/mL）作为对照。测定荧光素酶活性，并表示为相对于未刺激对照（K−）的折叠诱导。显示了三次测量的平均值±SD*P（P）与对照报告细胞系相比<0.05。显示了五个独立实验的代表性结果。(B类)使用Mincle-expressing报告细胞系，通过固相萃取洗脱液的HPLC分离获得的组分的Mincle-mediated活性评估。使用TDB（2µg/mL）和TNFa（100 ng/mL）作为对照。测定荧光素酶活性，并表示为相对于未刺激对照（K−）的折叠诱导。显示了三次测量的平均值±SD。显示了三个独立实验的代表性结果。(C类)负离子检测模式下分数7的质谱。(D类)离子在负离子模式下的碎裂光谱米/z第465.3113页C类显示了母体离子和产物离子的拟议化学结构。(E类)合成硫酸胆固醇负离子模式的碎片光谱。
图S2。
图S2。
皮肤脂质固相萃取后洗脱液的ESI-MS分析。(A类)负离子检测模式下的质谱。最高信号为硫酸胆固醇和磷酸肌醇。(B类)根据裂解光谱确定的某些油脂的化学配方。合成1-硬脂酰-2-花生四烯醇-锡-甘油-3-磷酸肌醇（也称为18:0–20:4磷酸肌醇）进一步用于结合研究，以评估Mincle受体与硫酸胆固醇相互作用的特异性。
图3。
图3。
硫酸胆固醇直接与Mincle结合，在体内外诱导Mincle介导的促炎信号传导。(A类)Mincle与硫酸胆固醇直接结合的表面等离子体共振分析。为了验证结合特异性，使用18:0–20:4磷脂酰肌醇。所示为与所示分析物浓度相关的双参考传感器图（空白表面和空白缓冲液参考）。(B类)硫酸胆固醇和TDB激活Mincle-表达报告细胞的剂量依赖性能力。测定荧光素酶活性，并表示为相对于未刺激对照的折叠诱导。显示了三次测量的平均值±SD*P（P）与对照报告细胞系中的激活相比，<0.05。显示了五个独立实验的代表性结果。(C类)硫酸胆固醇以Mincle-dependent的方式诱导促炎介质的分泌。用硫酸胆固醇（10μg/mL）刺激从Mincle-KO小鼠或野生型小鼠分离的BMDC。以TDB（10μg/mL）和LPS（10μg/mL）作为对照。显示了三次测量的平均值±SD*P（P）< 0.05. 显示了两个独立实验的代表性结果。(D类)皮下注射硫酸胆固醇引起的皮肤炎症反应由Mincle介导。(赖特)箭头所示区域的放大倍数更高。显示了三个独立实验之一的H&E染色切片的代表性显微照片。
图S3。
图S3。
超声波处理产生了一种稳定的硫酸胆固醇胶束溶液，适用于体内实验。硫酸胆固醇胶束的粒径分布(A类)超声治疗后立即(B类)1小时后。
图4。
图4。
敏克在过敏性接触性皮炎模型中促进过敏性皮肤炎症。Mincle-KO和野生型小鼠在其腹部对DNFB致敏，然后在双耳背上用相同的致敏剂激发。在最后一次DNFB暴露24小时后测量终点参数。作为阴性对照，在整个实验期间，将另外两组Mincle-KO和野生型小鼠暴露于不含DNFB的载体中*P（P）<0.05与WT(n个=每组6只小鼠；三个独立实验的综合数据）。显示平均值±SD。(A类)显示了小鼠致敏和挑战的时间表。C、 挑战；E、 实验终点；S、 敏化作用。(B类)耳朵厚度变化的动力学。(C类)显示了实验终点处小鼠耳朵的代表性照片。照片显示，Mincle-KO小鼠过敏性接触性皮炎的某些临床症状有所减轻，例如耳朵肿胀和发红。(D类)显示了实验终点野生型和Mincle-KO小鼠耳朵组织的典型H&E染色切片。(E类)通过流式细胞术评估实验终点耳组织中Gr1+/CD11b+髓系免疫细胞的招募(左侧)并以细胞百分比表示(赖特). (F类)在实验终点分析小鼠耳组织中细胞因子和趋化因子的产生。
图S4。
图S4。
硫酸胆固醇激活表达MCL的HEK–mMCL–NF-κB–Luc报告细胞的剂量依赖性能力（Clec4d）。使用TDB（2µg/mL）和TNFa（100 ng/mL）作为对照。测定荧光素酶活性，并表示为相对于未刺激对照（K−）的折叠诱导。显示了三次测量的平均值±SD*P（P）<0.05 vs.对照报告细胞的激活。显示了五个独立实验的代表性结果。
图S5。
图S5。
单次接触DNFB或载体后，完整皮肤和皮肤中硫酸胆固醇的定量。使用8-mm活检穿孔机采集皮肤样本，然后称重。在均质和油脂提取后，采用高效液相色谱-质谱检测法测定硫酸胆固醇的含量。给出了两个独立实验的组合数据。列出了平均值±SD(n个=每组10只小鼠）。应用DNFB不会导致每个皮肤活检样本的硫酸胆固醇数量出现统计上显著的变化。每克湿组织中观察到的硫酸胆固醇浓度下降可能是由于皮肤肿胀和活检样本重量增加所致。
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