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.2017年4月3日；216（4）：1123-1141。
doi:10.1083/jcb.201608094。 Epub 2017年3月13日。

激活人巨噬细胞后，FcγRI膜纳米簇与抑制性SIRPα分离

菲利帕·B·洛佩斯 1, 什特凡·巴林 1, 萨尔瓦托·瓦尔沃 2, 詹姆斯·费尔斯 2, 伊迪丝·海塞尔 三, 迈克尔·达斯汀 2, 丹尼尔·戴维斯 4
附属公司

激活人巨噬细胞后，FcγRI膜纳米簇与抑制性SIRPα分离

菲利帕·B·洛佩斯等。 J细胞生物学. .

摘要

激活Fc受体和抑制信号调节蛋白α（SIRPα）之间的信号整合控制巨噬细胞吞噬功能。这里，使用双色直接随机光学重建显微镜，我们报告了Fcγ受体I（FcγRI）、FcγRII和SIRPα在巨噬细胞表面不是均匀分布的，而是以离散的纳米团簇组织，平均半径分别为71±11 nm、60±6 nm和48±3 nm。FcγRI的纳米团簇（而非FcγRII）与SIRPα的纳米团束在62±5 nm范围内构成关联，由肌动蛋白细胞骨架介导。Fc受体激活后，Src家族激酶信号导致FcγRI和SIRPα纳米簇分离，间距为197±3 nm。SIRPα与CD47的共聚消除了纳米团簇分离。如果信号平衡有利于激活，FcγRI纳米团簇会重新组织成周期性间隔的同心环。因此，在信号整合的同时，激活和抑制受体的纳米和微米级重组发生在人类巨噬细胞表面。

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数字

图1。
图1。
SIRPα和FcγRI排列在巨噬细胞表面的离散纳米团簇中。（A和B）人类巨噬细胞表面SIRPα（A）和FcγRI（B）的TIRF和dSTORM图像，接种在PLL-（非活化，顶部）或hIgG涂层载玻片（底部）上10分钟，并用荧光标记的特异性抗体染色。棒材，5µm。用白色方块描绘的区域被放大，并用相应的密度图（伪彩色标度）、阈值二值图和Ripley对所选区域中分子的K分析来显示。棒材，1µm。L（r）-r表示相对于模拟随机分布的聚类程度，由99%置信区间（CI）表示；r是径向刻度。（C–E）通过对dSTORM数据进行空间点对分析和阈值化，计算非活化（黑色）或hIgG活化（灰色）条件下SIRPα和FcγRI的纳米团簇面积（C）、密度（D）和纳米团簇中定位百分比（E）。每个符号表示同一单元格中几个5×5µm区域的中值。水平线和误差条代表平均值±标准差。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。ns，不显著；****，P<0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。（F和G）SIRPα（F）和FcγRI（G）的标记密度变化分析产生了聚集蛋白的特征归一化ρ/η曲线。用不同标记浓度的抗-SIRPα-AF647（F）或抗-FcγRI-AF488（G）对细胞进行染色，并用dSTORM成像。每个数据点代表一个单个细胞，根据用于标记的抗体浓度进行颜色编码。红线表示分子随机分布的参考曲线。
图2。
图2。
SIRPα和FcγRI纳米团簇在未激活的人类巨噬细胞中构成相关，但在与hIgG激活后分离。（A） TIRF和dSTORM图像显示人类巨噬细胞表面FcγRI（绿色）和SIRPα（红色）在涂有PLL（非活化，顶部）或hIgG（中间）的载玻片上孵育10分钟，并用抗-FcγRI-AF488和抗-SIRPα-AF647 mAbs染色。棒材，5µm。由白色正方形（中柱）勾勒的区域被放大显示（右柱），沿着白线具有相对荧光强度分布。棒材，1µm。作为阳性对照，接种到PLL涂层载玻片上的巨噬细胞被抗-FcγRI-AF488单克隆抗体染色，随后被抗小鼠IgG1-AF647二级抗体染色（底部）。（B） 接种在PLL-（灰色）或hIgG-涂层（红色）载玻片上10分钟或阳性对照数据（绿色）的细胞中SIRPα和FcγRI共定位参数的单分子分布的CBC直方图。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。条形图表示平均值±标准偏差。（C）根据（B）所示数据进行的最近邻（NN）分析。每个符号表示来自一个细胞的所有成对单分子定位的中间NN。水平线和误差线代表平均值±标准偏差。****，P<0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。（D） 来自一个通道的纳米团簇的质心和来自第二个通道的最近邻居的质心之间的NND直方图分布（≥20000个团簇，每个条件下至少有10个细胞），来自接种到PLL-（浅灰色）、hIgG-涂层（浅红色）载片或阳性对照数据（绿色）的细胞。还显示了相应的模拟数据，其中SIRPα纳米团簇在非激活（深灰色）和hIgG激活条件（深红色）下的质心位置在细胞区域内随机化。
图3。
图3。
低亲和力Fc受体FcγRII排列在巨噬细胞表面的离散纳米簇中。（A和B）人类巨噬细胞表面FcγRII的TIRF和dSTORM图像，接种在PLL-（非活化）或hIgG涂层载玻片上10分钟（A）或30分钟（B），并用荧光标记的特异性抗体染色。棒材，5µm。白色方块所描绘的区域被放大，并用相应的密度图、二进制图和Ripley的K分析显示。棒材，1µm。（C–E）如图1所示，计算了FcγRII在10分钟或30分钟非活化（黑色）或hIgG活化（灰色）条件下的纳米团簇面积（C）、密度（D）和纳米团簇中的局域化百分比（E）。水平线和误差条代表平均值±标准偏差。数据来自三个独立供体的至少15个细胞。ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；****，P<0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。
图4。
图4。
SIRPα和低亲和力Fc受体FcγRII在纳米尺度上分离。（A） TIRF和dSTORM图像显示人类巨噬细胞表面的FcγRII（绿色）和SIRPα（红色）在涂有PLL（非活化）或hIgG的载玻片上孵育10或30分钟，并用抗-FcγRII-AF488和抗-SIRPα-AF647单克隆抗体染色。棒材，5µm。在每种情况下，由白色方块（中间列）勾勒出的区域被放大（右列），沿着白线显示相对荧光强度剖面。棒材，1µm。（B） SIRPα和FcγRII在接种到PLL或hIgG涂层载玻片上10分钟（分别为浅灰色和深灰色）或30分钟（分别是浅红色和深红色）或阳性对照数据（绿色）的细胞中的共定位参数的单分子分布的CBC直方图。图中的阳性对照数据与图2中的相同。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。条形代表平均值±标准偏差。（C）根据B所示数据进行的NND分析。每个符号代表一个细胞所有成对单分子定位的中间NND。水平线和误差条表示平均值±SD.ns，不显著；**，P<0.01；***，P<0.001；用Tukey的事后检验进行单因素方差分析（ANOVA）。（D） NND在一个通道的纳米团簇质心和第二个通道的最近邻居质心之间的直方图分布（每个条件下至少10个细胞中的≥20000个团簇）。a.u.任意单位；NN，最近邻；PC，阳性对照。
图5。
图5。
FcγRs活化后重组为同心环。（A） 在涂有PLL（非活化）或hIgG并用荧光标记的特异性抗体染色的载玻片上孵育10或30分钟的人巨噬细胞表面FcγRI（顶部）和FcγRII（底部）的TIRF图像。棒材，10µm。（B） 在涂有PLL或hIgG的载玻片上孵育10或30分钟后，用抗FcγRI-AF488和抗-FcγRII-AF647 mAbs染色的巨噬细胞表面FcγR I（绿色）和Fcγ-RII（红色）的TIRF和dSTORM图像。棒材，5µm。白色方块（中间一栏）勾勒出的区域被放大（右一栏），沿着白线显示相对荧光强度剖面。棒材，1µm。（C） 接种到PLL或hIgG涂层载片上10分钟（分别为浅灰色和深灰色）或30分钟（分别是浅红色和深红色）或阳性对照数据（绿色）的细胞中FcγRI和FcγRII的共定位参数的单分子分布的CBC直方图。图中的阳性对照数据与图2中的相同。数据来自三个独立供体的至少10个细胞。条形代表平均值±标准偏差。C中所示数据的（D）NND分析。每个符号代表一个细胞所有成对单分子定位的中位NND。水平线和误差条表示平均值±标准偏差ns，不显著；**，P<0.01；****，P<0.0001；Tukey的事后检验的单因素方差分析。（E） NND在一个通道的纳米团簇质心和第二个通道的最近邻居质心之间的直方图分布（每个条件下至少10个细胞中的≥20000个团簇）。a.u.，任意单位；NN，最近邻；PC，阳性对照。
图6。
图6。
FcγRI的特定活化是其重组为同心环和与SIRPα纳米团簇分离所必需的。（A和B）在涂有hIgG1或hIgG2并用抗-FcγRI-AF488和抗-SIRPα-AF647 mAbs染色的载玻片上培养10（A）或30分钟（B）后，显示人类巨噬细胞表面的FcγRI（绿色）和SIRPα（红色）。在每种情况下，由白色方块（中间列）勾勒出的区域被放大（右列），沿着白线显示相对荧光强度剖面。棒材，1µm。（C） FcγRI和SIRPα在接种到hIgG1或hIgG2涂层载玻片上10分钟（分别为浅灰色和深灰色）或30分钟（分别是浅红色和深红色）的细胞中的共定位参数的单分子分布的CBC直方图。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。条形图表示平均值±标准差。（D）C中所示数据的NND分析。每个符号表示一个细胞所有成对单分子定位的中值NND。水平线和误差条表示平均值±SD.ns，不显著；**，P<0.01；****，P<0.0001；使用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。（E） NND在一个通道的纳米团簇质心和第二个通道的最近邻居质心之间的直方图分布（每个条件下至少10个细胞中的≥20000个团簇）。a.u.，任意单位；NN，最近邻；PC，阳性对照。
图7。
图7。
由流动性hIgG触发的巨噬细胞表面受体的重新排列。（A） 在装载有链亲和素（非活化）或链亲和素hIgG（活化）并用荧光标记的特异性抗体染色的SLBs上孵育10分钟的人巨噬细胞表面的FcγRI的TIRF图像。针对每种情况显示了两个示例图像。棒材，10µm。（B） 接种为A的巨噬细胞表面FcγRI（绿色）和SIRPα（红色）的dSTORM图像，用抗-FcγRI-AF488和抗-SIRPα-AF647单克隆抗体染色。棒材，5µm。白色方块所勾勒的区域显示为沿着白线放大的相对荧光强度剖面。棒材，1µm。（C–E）SIRPα和FcγRI在非活化（黑色）或hIgG活化（灰色）条件下的纳米团簇面积（C）、密度（D）和纳米团簇中的局域化百分比（E）。每个符号表示同一单元格中几个5×5µm区域的中值。水平线和误差条代表平均值±标准偏差。数据来自两个独立实验的至少30个单元格。ns，不显著；*，P<0.05；****，P＜0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。（F） SIRPα和FcγRI在接种A的细胞中的共定位参数的单分子分布的CBC直方图。数据来自两个独立实验中的至少30个细胞。条形代表平均值±标准偏差。F中所示数据的（G）NND分析。每个符号代表一个细胞所有成对单分子定位的中位NND。水平线和误差线代表平均值±标准偏差。****，P<0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。（H） 来自一个通道的纳米团簇的质心和来自第二个通道的最近邻居的质心之间的NND直方图分布（≥10000个团簇，每个条件下至少10个细胞），来自接种到对照非激活（浅灰色）或携带hIgG的激活（浅红色）SLB的细胞。
图8。
图8。
SIRPα的连接削弱了表面FcγRI的重组。（A） 如图所示，将人巨噬细胞在涂有PLL、20µg/ml hCD47或在存在10µg/ml hIgG的情况下与浓度增加的hCD47的孔中孵育24小时。通过ELISA评估M-CSF释放。条形图表示三位捐赠者的平均值±标准偏差。每种颜色代表一个捐赠者。（B） 人巨噬细胞表面FcγRI在涂有hCD47或hCD47加hIgG的载玻片上孵育10分钟后的TIRF图像，并用荧光标记的特异性抗体染色。棒材，10µm。（C） TIRF和dSTORM图像显示人类巨噬细胞表面FcγRI（绿色）和SIRPα（红色）在涂有hCD47（顶部）或hCD47加hIgG（底部）的载玻片上孵育10分钟，并用抗-FcγRI-AF488和抗-SIRPα-AF647单克隆抗体染色。棒材，5µm。在每种情况下，由白色方块（中间列）勾勒出的区域被放大（右列），沿着白线显示相对荧光强度剖面。棒材，1µm。FcγRI和SIRPα（D）以及FcγR I和pSHP-1的共定域参数的单分子分布的（D和G）CBC直方图Y536年（G） 细胞接种到涂有PLL（浅灰色）、hCD47（浅红色）、hCD47加hIgG（深红色）或hIgG-（深灰色）的载玻片上10（D）或5分钟（G）。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。条形代表平均值±标准差。（E和H）NND分析分别来自D和G中显示的数据。每个符号表示来自一个细胞的所有成对单分子定位的中间NND。水平线和误差条表示平均值±标准偏差ns，不显著；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001；使用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。（F和I）一个通道的纳米团簇质心和第二个通道的最近邻居质心之间NND的直方图分布（每个条件下至少10个细胞中≥20000个团簇）。图比较了FcγRI和SIRPα（F）以及FcγRI与pSHP-1之间的共定域Y536年（一） ●●●●。a.u.，任意单位；NN，最近邻；PC，阳性对照。
图9。
图9。
FcγRI的分离和重组依赖于肌动蛋白细胞骨架和formins，而不是肌球蛋白II。（A） 用1µm latrunculin A、0.5µm jasplakinolide、10µm blebbistatin或10µm SMIFH2预处理的人类巨噬细胞表面FcγRI（白色；条形，20µm）的TIRF图像和FcγR（绿色）和SIRPα（红色）的dSTORM图像。然后将细胞接种到涂有PLL（非活化）或hIgG的载玻片上10分钟，并用抗FcγRI-AF488和抗SIRPα-AF647单克隆抗体染色。在每种情况下，由白色方块（中间列）勾勒出的区域都会放大显示（右列）。棒材，1µm。（B） FcγRI和SIRPα在经药物预处理的细胞中的共定位参数的单分子分布的CBC直方图，如图所示，将其接种到涂有PLL（灰色）或hIgG（latrunculin A[Lat A]，深灰色；茉莉花碱内酯[Jasp]，红色；SMIFH2，绿色；或blebbistatin[Bleb]，蓝色）的载玻片上10分钟。数据来自三名独立捐赠者每种情况下至少30个细胞。条形代表平均值±标准偏差。（C）根据B所示数据进行的NND分析。每个符号代表一个细胞所有成对单分子定位的中间NND。水平线和误差条表示平均值±SD.ns，不显著；**，P<0.01；****，P<0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。（D） NND在一个通道的纳米团簇质心和第二个通道的最近邻居质心之间的直方图分布（每个条件下至少10个细胞中的≥20000个团簇）。（E–G）在非活化（黑色）或hIgG-活化（灰色）条件下，用玻利司他丁或二甲基亚砜对照预处理细胞后，SIRPα和FcγRI的纳米团簇面积（E）、密度（F）和纳米团簇定位百分比（G）。每个符号表示同一单元格中几个5×5µm区域的中值。水平线和误差条代表平均值±标准偏差。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P＜0.0001；双尾t吨假设方差不相等的检验。NN，最近的邻居。
图10。
图10。
Src家族激酶信号，而不是Syk或PI3K信号，是巨噬细胞表面重组所必需的。（A） 用载体（DMSO）预处理的非活化（PLL）或hIgG活化的人类巨噬细胞中磷酸化AKT的免疫印迹，作为对照，10µM PP2（左）、100µM piceatannol（PCT；中）或1µM wortmannin（Wort；右）。印迹代表两个独立的实验。（B） 与载体（DMSO）、PP2、PCT或Wort孵育的人类巨噬细胞表面FcγRI（白色；条形，20µm）的TIRF图像和FcγRI（绿色）和SIRPα（红色）的dSTORM图像（条形，5µm或hIgG 10分钟，用抗-FcγRI-AF488和抗-SIRPα-AF647单克隆抗体染色。在每种情况下，由白色方块（中间列）勾勒出的区域都会放大显示（右列）。棒材，1µm。（C） 如图所示，将预先处理过的细胞（如A中所示）中FcγRI和SIRPα的CBC直方图接种到涂有PLL（灰色）或hIgG（DMSO，深灰色；PP2，红色；PCT，绿色；和Wort，蓝色）的载玻片上10分钟。数据来自三个独立供体的至少30个细胞。条形图显示平均值±标准偏差。C中所示数据的（D）NND分析。每个符号表示一个细胞所有成对单分子定位的中位NND。水平线和误差条表示平均值±标准偏差ns，不显著；****，P<0.0001；使用Tukey的事后检验进行单因素方差分析。（E） NND在一个通道的纳米团簇质心和第二个通道的最近邻居质心之间的直方图分布（每个条件下至少10个细胞中的≥20000个团簇）。
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