跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年3月7日;18(10):2508-2520.
doi:10.1016/j.celrep.2017.02.042。

Rif1-PP1逆转DDK介导的MCM磷酸化独立于ATR/Chk1调节复制起始和复制体稳定性

附属公司

Rif1-PP1逆转DDK介导的MCM磷酸化独立于ATR/Chk1调节复制起始和复制体稳定性

罗伯特·C·阿尔弗等。 单元格代表. .

摘要

Dbf4依赖性激酶(DDK)是启动DNA复制所必需的,其基本靶点是MCM2-7蛋白。我们表明,在非洲爪蟾卵提取物和人类细胞中,DNA-结合Mcm4的超磷酸化,而非Mcm2的磷酸化与DNA复制相关。DDK抑制剂PHA-767491和XL413对这些磷酸化有不同的影响。我们表明,依赖DDK的MCM磷酸化被Rif1靶向染色质的蛋白磷酸酶1(PP1)逆转。Rif1的缺失增加了MCM磷酸化和复制起始速率,也损害了细胞在用复制抑制剂攻击时阻断起始的能力。我们还提供证据表明,Rif1可以在复制分叉处介导MCM去磷酸化,去磷酸化复制体的稳定性强烈依赖于Chk1的活性。我们认为,复制起始和复制体稳定性都依赖于MCM磷酸化,而MCM的磷酸化是通过DDK依赖的磷酸化和Rif1介导的去磷酸化的平衡来维持的。

关键词:Cdc7;DNA损伤;DNA复制;MCM;里夫1;爪蟾卵无细胞体系;检查点信号;人体组织培养。

PubMed免责声明

数字

无
图形摘要
图1
图1
不同MCM亚基的磷酸化爪蟾DDK被PP1(A–C)逆转爪蟾用去膜精子核补充卵子提取物,并任选地补充50μM PHA-767491(PHA)或100μM XL413(XL)。(A) 培养40分钟后,对分离的染色质和0.5%(v/v)的上清液进行Mcm4、Mcm2-P-S40、Mcm2-P-S53和总Mcm2的免疫印迹。(B) 在指定的时间,分离染色质并对Mcm4、Mcm2-P-S40、Mcm2-P-S53、总Mcm2、PCNA和组蛋白H3进行免疫印迹。(C) 提取物补充了[α-32P] dATP。在指定时间测定总DNA合成。(D和E)精子细胞核在爪蟾p27处理的鸡蛋提取物基普1允许Mcm4过度磷酸化。然后添加50μM PHA-767491或100μM XL413加或减1μM牛磺酸霉素(Tauto),在添加抑制剂后立即分离染色质(60分钟),或随后每隔5分钟分离染色质,持续20分钟(65–80分钟)。对染色质样品进行Mcm4、Mcm2-P-S40、Mcm2-P-S53、总Mcm2和组蛋白H3的免疫印迹。
图2
图2
人Mcm4磷酸化预测DNA复制(A和B)HeLa细胞在M期早期通过有丝分裂振荡同步化,然后进行不同时间的替换。(A) 流式细胞术测定细胞DNA含量。(B) 染色质内外Mcm4、总Mcm2和Mcm2-P-S40的免疫印迹。层粘连蛋白B和微管蛋白起着装载和分馏控制作用。(C) 如(A)所示同步细胞,并在培养基中用10μM PHA-767491或10μM XL413替换细胞。在7.5小时时,用EdU将细胞脉冲30分钟,然后通过流式细胞仪分析DNA含量和EdU掺入。图中显示了一个示例图和门,以及三个实验中EdU+细胞的平均值和SD。(D) 细胞与(A)中的细胞同步,并重新放置8小时(t-2);然后任选地向培养基补充10μM PHA-767491(PHA)、10μM XL413或225 nM牛磺酸霉素(Tauto),如所示,持续2小时。然后对细胞进行染色质上和染色质下的Mcm4、Mcm2-P-S40、Mcm2-P-S53或总Mcm2的免疫印迹。层粘连蛋白B和微管蛋白作为负荷和分馏控制。另请参见图S1。
图3
图3
Rif1在复制起点将PP1靶向MCM(A和B)爪蟾鸡蛋提取物(A)或HeLa细胞核提取物(B)使用抗Rif1抗体或免疫前兔IgG,并对样品进行Rif1、PP1γ、PP1β、PP1α、Mcm2或Cdc7免疫印迹,如图所示。(C) 精子细胞核在爪蟾使用抗Rif1抗体(ΔRif1)或对照免疫前兔IgG(ΔIgG)提取免疫缺失的提取物。精子细胞核和p27基普1添加到提取物中以允许Mcm4超磷酸化。培养后60和75分钟分离染色质。或者,在与DNA孵育60分钟后,添加50μM PHA-767491(PHA),并在接下来的25分钟(65–85分钟)内在指定时间分离染色质。对染色质样品进行Mcm4、Mcm2-P-S40、Mcm2-P-S53、Mcm7、Rif1和PP1γ免疫印迹。(D) 用更多靶向Rif1的siRNA转染HeLa细胞,并在转染后24和48小时测试敲除效率以及Mcm4磷酸化。Mcm5充当加载控件(Ctrl)。(E) 转染Rif1或对照RNAi后约48小时,HeLa细胞通过有丝分裂振荡在S期同步,并用10μM PHA-767491(PHA)或10μM XL413(XL)处理30分钟。染色质结合的Mcm4通过免疫印迹进行分析,Mcm5作为负载对照。另请参见图S2。
图4
图4
正常复制(A和B)控制(ΔIgG)和耗尽Rif1(ΔRif1)需要Rif1/PP1活性来对抗Cdc7活性爪蟾提取物与去膜精子细胞核和[α-32P] dATP。(B) 选择性地向提取物中添加浓度增加的PHA-767491(PHA)(0.75-6μM)。在指定的时间(A)或150分钟(B)停止反应,并测定总DNA合成。(C和D)流式细胞术用于分析以下实验中的细胞DNA含量:用对照或Rif1 siRNA转染HeLa细胞,通过双胸苷块同步,并释放到未经处理(C)或XL413处理(D)的培养基中指定时间。(E) 用EdU对来自(C)和(D)的6小时时间点的细胞进行脉冲处理,并用流式细胞仪进行分析。另请参见图S4。
图5
图5
用对照或Rif1 siRNA处理Rif1抑制复制启动(A–D)HeLa细胞,用双胸苷阻断同步化,然后释放。(A) 在释放后的指定时间段,用EdU对细胞进行30分钟的脉冲处理。用荧光显微镜检查DNA合成的空间模式。释放后90分钟(B–D),对细胞核的总EdU强度(B)、每个细胞核的复制病灶数(C)和EdU病灶强度(D)进行量化(每个条件25个细胞核)。(E) 在胸腺嘧啶核苷(Thy)释放70分钟后,用CldU标记细胞20分钟,清洗并用IdU短暂脉冲(10分钟)。DNA纤维扩散,并测量100个CldU标记轨迹的长度。使用非配对双尾t检验评估数据的显著性。另请参见图S5。
图6
图6
Rif1与ATR/Chk1(A–C)HeLa细胞平行调节S期进展和复制体稳定性,用对照或Rif1 siRNA处理HeLa电池,同步并从双胸苷块释放2小时,然后任选地用咖啡因(5 mM)、CHIR-124、KU55933、XL413或足叶乙甙处理2小时,如图所示。在治疗的最后30分钟内加入EdU,并通过流式细胞仪对细胞进行分析。(D) 用对照或Rif1 siRNA处理HeLa细胞,同步并从双胸苷(Thy)块中释放70分钟,用CldU标记20分钟,清洗,然后用IdU标记,同时用CHIR-124(CHIR)、依托泊甙(ETO)或两者孵育1小时。制备DNA纤维,并在每个实验条件下计算100个径迹的IdU长度。使用非配对双尾t检验评估数据的显著性,未经处理的siCtrl和未经处理siCtrl ETO+CHIR之间的纤维长度存在显著差异(p<0.0001),未经治疗的siCtrl-和未经治疗siRif1之间的纤维长存在显著差异。在任何siRif1处理之间均未发现显著差异。
图7
图7
Rif1-PP1调节复制体稳定性和S期进展(A)精子核在爪蟾鸡蛋提取物补充100μM蚜虫精和5 mM咖啡因。再添加50μM PHA-767491(PHA)±1μM牛磺霉素(Tauto)25分钟。用抗Cdc45或免疫前绵羊IgG抗体免疫沉淀染色质结合蛋白。对样品进行Cdc45、Mcm4、Mcm2-P-S40、Mcm2-P-S53、总Mcm2和Psf2免疫印迹。(B)爪蟾鸡蛋提取物中添加去膜精子核和100μM蚜虫灵。60分钟后,第27页基普1并用50μM PHA--767491±5mM咖啡因(CAFF)补充等分试样。再过25分钟,将染色质转移到添加了[α-32P] dATP、p27kip1和50μM PHA-767491±5 mM咖啡因与第一次培养相匹配。在指定的时间,加入[α-32P] 测定进入新生DNA的dATP,并将其表达为针对1分钟掺入的标准化值。(C) 用对照或Rif1 siRNA处理HeLa细胞,用双胸苷阻断同步,并在用羟基脲(HU;5 mM)、蚜虫灵(APH;1μg/mL)、甲基磺酸甲酯(MMS;0.02%)、喜树碱(CPT;5μM)、依托泊苷(ETO;5μM)或紫外线(~45 J/M)处理前2小时释放2). 在治疗的最后30分钟和开始治疗2小时后添加EdU,收集、固定细胞,并通过流式细胞仪进行分析。(D) Rif1和Cdc7在控制复制起始和复制体稳定性中的作用模型。复制起始由Cdc7对Mcm2-7的磷酸化调节,而Rif1/PP1则相反。活性复制体也被Rif1/PP1去磷酸化,这需要ATR/Chk1来稳定它们以应对复制应激。另请参见图S6。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Bruck I.,Kaplan D.L.。Dbf4-Cdc7激酶促进Mcm2-7环开放,以允许单链DNA挤压和解旋酶组装。生物学杂志。化学。2015;290:1210–1221。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cornacchia D.、Dileep V.、Quivy J.P.、Foti R.、Tili F.、Santarella-Mellwig R.、Antony C.、Almouzni G.、Gilbert D.M.、Buonomo S.B.小鼠Rif1是哺乳动物细胞复制定时程序的关键调节器。EMBO J.2012;31:3678–3690.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Costanzo V.、Shechter D.、Lupardus P.J.、Cimprich K.A.、Gottesman M.、Gautier J.抑制DNA复制起始的依赖ATR和Cdc7的DNA损伤检查点。分子细胞。2003;11:203–213.-公共医学
    1. DavéA.、Cooley C.、Garg M.、Bianchi A.。Rif1的蛋白磷酸酶1募集通过抵消DDK活性调节DNA复制源的激发。细胞报告2014;7:53–61.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Foti R.、Gnan S.、Cornacchia D.、Dileep V.、Bulut-Karslioglu A.、Diehl S.、Buness A.、Klein F.A.、Huber W.、Johnstone E.由Rif1组织的核架构支持复制定时计划。分子细胞。2016;61:260–273.-项目管理咨询公司-公共医学