Sorting Nexin 9 facilitates podocin endocytosis in the injured podocyte

doi:10.1038/srep43921

.2017年3月7日7:43921。

doi:10.1038/srep43921。

分选Nexin 9促进受损足细胞中的足细胞内吞作用

附属机构

¹日本东京君天道大学医学院内科肾脏科。
²日本东京君天道大学医学研究生院研究支持中心蛋白质组学和生物分子科学实验室。
^三日本京都大学医学研究生院TMK项目医学创新中心。
⁴日本东京医学和牙科大学医学研究生院儿科和发育生物学系。

PMID： 28266622
预防性维修识别码：项目编号5339724
内政部： 10.1038/报告43921

分离Nexin 9促进受损足细胞内吞足霉素

Yu Sasaki先生等。科学代表. 2017.

.2017年3月7:7:43921。

doi:10.1038/srep43921。

附属机构

¹日本东京君天道大学医学院内科肾脏科。
²日本东京君天道大学医学研究生院研究支持中心蛋白质组学和生物分子科学实验室。
^三日本京都大学医学研究生院TMK项目医学创新中心。
⁴日本东京医学和牙科大学医学研究生院儿科和发育生物学系。

PMID： 28266622
预防性维修识别码：第5339724页
内政部： 10.1038/srep43921

摘要

肾小球硬化改变的不可逆性取决于足细胞损伤的程度。我们之前已经证明了在严重损伤的足细胞中，足苷向亚细胞区域的内吞易位，并发现这一过程是主要的疾病触发因素。在这里，我们在酵母双杂交分析中确定了蛋白排序连接蛋白9（SNX9）作为podocin内吞的新促进剂。SNX9参与网格蛋白介导的内吞、肌动蛋白重排和囊泡转运调节。我们的结果揭示并证实了SNX9仅通过SNX9的Bin Amphyphysin Rvs（BAR）结构域与足霉素相互作用。免疫荧光染色显示了SNX9在体内外对足细胞阿霉素诱导的损伤的反应。最后，对人类肾小球疾病活检样本的分析表明，SNX9在代表严重足细胞损伤的样本中有较强的表达，并与podocin共定位，例如预后不良的IgA肾病、膜性肾病和局灶节段性肾小球硬化。总之，我们确定SNX9是严重足细胞损伤中足细胞内吞podocin的促进剂，并证明了SNX9在肾病模型小鼠和患有不可逆肾小球疾病的人类患者的足细胞中的表达。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

**图1。SNX9的BAR结构域与podocin相互作用。**
(一)SNX9及其域结构示意图。(b条)用FLAG标记的podocin和GFP-SNX9截短突变体联合转染HEK293T细胞；用抗GFP或抗FLAG抗体对产生的免疫沉淀进行免疫印迹。下部面板显示了用抗GFP抗体对总细胞裂解物进行的免疫印迹，以验证每个截断突变的表达。IP，免疫沉淀。(**c（c）**)孵育GST–SNX9融合蛋白或单独GST，每个裂解物用于下拉分析。复合物通过SDS-PAGE溶解，并用抗FLAG抗体进行免疫印迹。(d日)免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，内源性SNX9与ADR处理的培养人足细胞中的足细胞素相互作用。抗SNX9抗体沉淀SNX9和共沉淀podocin。相反，抗podocin抗体沉淀podocin和共沉淀SNX9。抗-GFP抗体没有沉淀SNX9和podocin。

**图2。SNX9与podocin在转染COS7细胞中共定位。**
野生型COS7细胞中瞬时表达GFP标记SNX9截断突变体（绿色）、FLAG标记podocin（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光分析。方框表示右侧显示的放大倍数较高的区域。

**图3。在ADR诱导的肾病小鼠中可以检测到SNX9表达增加和与podocin共定位。**
SNX9（绿色）和podocin（红色）免疫染色后ADR诱导肾病小鼠肾小球的荧光显微照片；合并区域用黄色表示。方框表示右侧显示的放大倍数较高的区域。比例尺，20 微米。

**图4。在ADR处理的WT足细胞的细胞质中可以检测到SNX9表达增加以及与podocin共定位，而SNX9 KD足细胞几乎没有podocin的细胞质表达。**
(一)ADR治疗前后用SNX9（绿色）和足苷（红色）染色的培养的人足细胞的荧光显微照片（合并区域为黄色）。DAPI（蓝色）表示细胞核。方框表示下部面板中显示的放大倍数较高的区域。(b条)在线性OptiPrep梯度（5-25%）上分离的来自对照足细胞或用ADR处理的足细胞的组分的蛋白质印迹分析。western blot分析检测SNX9和podocin的分布，以及质膜（小窝蛋白）、内体/溶酶体（LAMP1）、线粒体（F1F0-ATPase的β亚基）和内质网（calnexin）的标记蛋白。(**c（c）**)用无功能对照siRNA（上面板）或SNX9 siRNA（中面板和下面板）转染培养的人足细胞。*转染细胞，*由决定*GFP公司*表达式由箭头表示。上面板：对照siRNA-转染足细胞的荧光显微照片，用SNX9染色（红色）。中间面板：SNX9 siRNA转染足细胞经ADR处理后的荧光显微照片，SNX9染色（红色）。下面板：用podocin（红色）染色的SNX9 siRNA-转染足细胞经ADR处理的荧光显微照片。DAPI（蓝色）表示细胞核。方框表示右侧显示了更大的区域。

**图5。SNX9定位于转染COS7细胞中的早期内体。**
短暂表达的GFP标记SNX9（绿色）、EEA1（红色，上面板）或Rab5（红色，下面板）和DAPI（蓝色）的三酸盐染色。方框表示右侧显示的放大倍数较高的区域。

**图6。在与人类肾脏疾病相关的严重足细胞损伤的背景下，SNX9强烈表达并与足细胞素共定位。**
(一)SNX9（绿色）和podocin（红色）免疫染色的人肾活检标本肾小球荧光显微照片；合并区域显示为黄色。肾脏样本经病理诊断。(b条)人类肾脏活检标本中每个肾小球的SNX9强度。每名患者检查两个以上肾小球，每种疾病检查六个以上患者，并使用Tissue Studio（德国慕尼黑Definiens；*P < 0.05或**P < 0.001，单因素方差分析）。(**c（c）**)人类肾脏活检标本中每个肾小球SNX9/podocin合并区域的强度。每个患者检查两个以上的肾小球，每个疾病检查六个以上的患者。SNX9/podocin合并区域使用Tissue Studio自动量化（德国慕尼黑Definiens；*P < 0.05或**P < 0.001，学生t检验）。比例尺，50 微米。

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1. Tryggvason K.、Patrakka J.和Wartiovaara J.《遗传性蛋白尿综合征和蛋白尿机制》，英国新泽西州。《医学杂志》3541387-1401（2006）。-公共医学
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[10] Huber T.B.等人，功能性podocin-neprin复合体的分子基础：NPHS2基因突变破坏了靶向脂筏微结构域的nephrin。嗯，分子遗传学。12, 3397–3405 (2003).-公共医学

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