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.2017年3月6日：e17304。
doi:10.7554/eLife.17304。

KChIP2是心脏兴奋性的核心转录调节因子

Drew M Nassal公司 1 2, 小平万 1, 刘海燕 1, 丹妮尔·马莱斯基 1, 安吉丽娜·拉米雷斯-纳瓦罗 1, 克里斯汀·莫拉维克 三, 埃克哈德·菲克 1, 肯尼思·劳里塔 1, 伊莎贝拉·德什涅斯 1 2
附属公司

KChIP2是心脏兴奋性的核心转录调节因子

Drew M Nassal公司等。 埃利夫. .

摘要

异常电重构引起的心律失常是心脏病患者死亡的主要原因。在众多的重塑事件中，离子通道亚单位KChIP2的表达减少在许多心脏疾病中持续观察到。然而，KChIP2缺失是否仅仅是一种症状或与疾病发展有关尚不清楚。利用大鼠和人源性心肌细胞，我们确定了之前未观察到的对维持电稳定性至关重要的心肌KChIP2转录能力。通过与遗传元素的相互作用，KChIP2转录抑制miRNAs miR-34b和miR-34c，随后靶向关键去极化(我纳)和复极(我到)心脏病中电流的改变。在病理条件下，通过基因维持KChIP2表达或抑制miR-34可恢复通道功能，并可预防折返性心律失常的发生。这表明KChIP2/miR-34轴是发生电功能障碍的中枢调节器，并揭示miR-34是治疗心脏病心律失常的治疗靶点。

关键词：INa；伊藤；KChIP2；Kv4.3版本；导航1.5；细胞生物学；心力衰竭；人；人类生物学；药物；老鼠。

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利益冲突声明

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数字

图1。
图1.与KChIP2表达变化相关的miR-34调控。
(A类)显示日志的miRNA微阵列结果2KChIP2 siRNA处理72小时后miR表达的折叠变化。箭头表示miR-34b和−34c在改变的miRNAs组中。使用TargetScan 7.1对mRNA靶点的miRNAs分析仅限于上述两倍诱导（虚线）(B类)表中列出了KChIP2沉默后miRNAs至少增加或减少两倍的列表。(C类)SCN5A、SCN1B和KCND3基因的3'-UTR与来自大鼠的miRs-34b/c对齐，显示种子区域的杂交。灰色字母表示miR-34b和−34c之间的序列变化。SCN5A和SCN1B显示了一个相互作用的单一位点，而KCND3存在两个位点。(天)实时qPCR分析显示转染KChIP2.3（n=5）、KChIP2.6（n=6）、KCh IP2.4（n=4）或KChIP2 siRNA（n=4-5）的NRVM中对照细胞miR-34b/c表达的百分比变化。(E类)天然成年大鼠心脏组织的细胞质、膜和核部分。采用乳酸脱氢酶（LDH）、Serca2a和Lamin-B分别作为细胞质、膜和核标记物来评估KChIP2的核定位。(F类)成年大鼠心室肌细胞的典型z堆栈图像。核染色区域（DAPI，蓝色）显示细胞溶质蛋白LDH（绿色）缺失，而KChIP2（红色）染色显示明显的共定位。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05**与对照组相比，p<0.01。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.003
图2。
图2 KChIP2通过与启动子中假定的DRE基序直接相互作用抑制miR-34b/c表达。
(A类)miR-34b/c启动子的−500到−191的一个区域被克隆到无启动子荧光素酶结构体pGL4.10中。在KChIP2.3（n=3）、KChIP2.6（n=8）或KChIP2.33（n=3）存在的情况下，将该构建物联合转染到COS-7细胞中，并与单独的GFP进行比较。雷尼林（pGL4.74）作为正常对照。结果被描述为与单独GFP相比活性的%变化。(B类)在天然成年大鼠心肌细胞上进行的IgG和KChIP2 ChIP PCR。位于克隆启动子内的目标引物位点在下拉（n=3）后被评估富集，显示目标区域显著富集。(C类)在COS-7细胞中进行荧光素酶分析，以评估删除miR-34b/c启动子中假定DRE位点的结果。在KChIP2.6存在下，用插入pGL4.10载体中的相同WT报告构建体或删除DRE基序转染COS-7细胞。活性归一化为肾素（pGL4.74）。与WT（n=9）相比，KChIP2.6对miR-34b/c启动子（n=4）的抑制作用部分被KChIP2相互作用位点（DRE基序）的缺失所抵消。(天)用KChIP2.6和含有WT miR-34b/c启动子的pGL4.10转染的COS-7细胞用或不用10mM咖啡因处理6小时，导致启动子激活（n＝4）。结果归一化为肾素活性。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05**与对照组相比，p<0.01。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.004
图3。
图3 miR-34a/b/c通过与3'-UTR相互作用直接调节心脏离子通道。
(A类)收集miR-34b/c过表达NRVM前体的mRNA转录水平。结果（归一化为非靶向miR）显示SCN5A和SCN1B下调，但KCND3水平不变（n=7–8）。(B类)过度表达miR-34b的NRVM的蛋白质水平显示Kv4.3（KCND3）的蛋白质表达降低。Kv4.3的多条带代表蛋白质的不同糖基化状态。(C类)Kv4.3（n=4）的immunblot的摘要数据。(天)SCN5A、SCN1B和KCND3基因的3'-UTR与miRs-34b/c对齐，种子区域发生突变（以红色突出显示）以中断种子区域的相互作用。(E类)将3'-UTR克隆到pmiRGlo报告子结构中的报告子分析。转染WT或突变3'-UTR的HEK细胞中的荧光素酶活性。结果显示为非靶向miR前体（n=5）归一化为肾素活性的百分比变化。(F类)I的I/V曲线纳对照组（n=24）、miR-34b（n=24）或miR-34c（n=18）的NRVM过表达前体中测定。(G公司)I的I/V曲线至，总计对照组（n=15）、miR-34b（n=12）或miR-34c（n=11）的NRVM过表达前体中测定。(H（H）)我至，f还通过I的动态减法在NRVM中进行了评估到，s结果I/V曲线显示，与对照组（n=16）相比，miR-34b（n=14）和miR-34c（n=15）前体处理细胞的电流密度显著降低。(我)对同时表达对照或miR-34b/c前体的人源性心肌细胞（iCells）进行相同的实验，测量I纳（对照组，n=24；miR-34b/c，n=21）和(J型)我至，总计（对照组，n=24；miR-34b/c，n=25）。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05**与对照组相比，p<0.01。另请参见图3-图补充1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.005
图3——图补充1。
图3补充了miR-34b/c前体表达后NRVM中1..Kv4.2（kcnd2）的表达。
Kv4.2的RT-qPCR检测(千立方厘米)在NRVM中过度表达miR-34b/c前体后。结果反映了相对于对照miR-前体的褶皱变化（n=7）。而高程千立方厘米miR-34b/c过度表达后并不显著，在中呈强烈趋势的升高提示Kv4.2的代偿性上调，这有助于减少我到在NRVM中，尽管Kv4.3损失巨大。数据表示为平均值±SEM。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.006
图4。
图4体外心脏病信号转导将KChIP2缺失与miR-34升高联系起来。
(A类)100μM PE治疗NRVM 48小时后相对kcnip2的实时qPCR评估（n=6）。结果归一化为核糖体蛋白RPL27。(B类)在48小时治疗期间，评估NRVM中miR-34b（n=8）和miR-34c（n=7）的相对表达，以维持KChIP2的表达。表达水平归一化为小核仁RNA，U87。(C类)相同的处理条件(B类)，评估SCN5A（n=10）、SCN1B（n=100）和KCND3（n=7）的相对mRNA表达。(天)I的功能电流电压测量纳来自受控NRVM（n=29）、PE+Ad.GFP（n=27）和PE+Ad.KChIP2（n=30）。(E类)I的I/V曲线至，f对照组（n=7）、PE+Ad.GFP（n=9）和PE+Ad.CChIP2（n=8）中的记录。数据显示为平均值±SEM。与PE+Ad.GFP相比，表明或与对照组相比，数据显示为*p<0.05，**p<0.01。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.007
图5。
图5人类心力衰竭中KChIP2/miR-34b/c轴的保存。
(A类)从非衰竭（NF）患者（n=8）和衰竭患者（n=20）的左心室取人组织，评估KChIP2和miR-34b/c RNA的表达。KChIP2水平归一化为GAPDH，miR表达为小核仁RNA U6。(B类)对人类miR-34b/c的评估显示，如MatInspector预测的那样，在miR-34b干环（−242 bp）附近有一个保守的DRE基序，表明KChIP2活性在miR-34 b/c表达调控中保持不变。(C类)人类心力衰竭组织评估RNA水平SCN5A系列,SCN1B型、和KCND3公司观察到心力衰竭样本（n=20）显著减少SCN5A系列和KCND3公司，但不适用于SCN1B型与非衰竭组织相比（n=8）。(天)SCN5A、SCN1B和KCND3基因的3'-UTR与人类miRs-34b/c的比对。灰色字母表示miR-34b和−34c之间的序列变化。SCN5A有一个单一的相互作用位点，与大鼠的观察结果相匹配，而KCND3公司与在大鼠体内观察到的两个位点相比，有三个潜在位点。值得注意的是，SCN1B miR-34b/c靶向性在人类中并不保守，这表现在种子区的不完全杂交。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05**与对照组相比，p<0.01#p<0.05##聚丙烯与PE+Ad.GFP相比<0.01。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.008
图6。
图6..miR-34块逆转了两个I的丢失纳和我到在疾病信号中。
(A类)我纳在转染非靶向反病毒（对照，n=26）、非靶向miR+100μM PE（PE+对照反病毒，n=20）或miR-34b/c反病毒+100μM PE（PE+miR-34反病毒，n=21）的NRVM中测量48小时的I/V曲线(B类)我至，总计NRVM中显示电流密度的I/V测量值在PE+对照组（n=16）中丢失，而在PE+miR-34反间谍组（n=16）中保持较低水平，而对照组（n=17）细胞中则相反。(C类)我至，fNRVM中的I/V测量。与对照组（n=27）相比，用PE+对照反义病毒（n=22）处理的细胞电流密度降低，现在在PE+miR-34反义病毒细胞（n=23）中部分恢复。(天)I的I/V曲线纳在iCells中采集的数据显示，与PE+对照组（n=6）相比，miR-34反导物（n=5）可以将电流密度恢复到对照组（n=6）。(天)I的I/V曲线至，总计在有PE（n=15）存在的情况下，iCells中显示miR-34b/c反ir的测量结果可以将电流密度恢复到控制（n=115），而PE+控制（n=15）保持降低。数据以平均值±SEM表示。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，如指示或与对照组antimir相比，#p<0.05，##p<0.01，与PE+对照组antmir相比。另请参见图6——图补充1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.009
图6——图补充1。
图6——图补遗1。。我氪对PE刺激后的miR-34阻断不敏感。
(A类)我氪在转染非靶向抗ir（对照组，n=6）、非靶向miR+100μM PE（PE+对照组抗ir，n=5）或miR-34b/c抗ir+100μM PE（PE+miR-34抗ir，n=6）的iCells中测量48小时的I/V曲线。缺乏恢复表明miR-34b/c靶向特定离子通道转录物的特异性。数据显示为平均值±SEM。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.10
图7。
图7.miR-34阻滞在长时间PE治疗后保留NRVM单层的兴奋性。
(A类)用非靶向控制或miR-34b/c反ir向PE（100μM）提交单分子膜的等时导电图。顶行上的传导图表示S2之前的最后S1（750 ms），显示传播中没有预先存在的异常。平方函数表示起搏部位。第二行显示捕捉过早刺激的首次发生率（S2）。PE+对照反义药物导致起搏部位周围出现明显传导阻滞（实线）。对照组和PE+miR-34b/c抗ir组的传导阻滞最小。(B类)传导图显示了PE+对照反导治疗组持续再入的示例，如所示(A类). (C类)S1S2起搏后持续再入的总结数据。(天)APD恢复曲线80在起搏NRVM单分子膜中，用对照抗ir（n=6–8）、PE+对照抗ir，或PE+miR-34b/c抗ir（n=7–12）处理。(E类)用对照反铱（n=6–8）、PE+对照反钯（n=6–11）或PE+miR-34b/c反钯处理的起搏NRVM单层的传导速度恢复曲线（n=17–12）。(F类)测量受影响的不应性间期，通过确定最短的早期刺激来评估，这些刺激将引发捕获或心律失常诱导，受控制组（n=6）、PE+对照组antimir（n=13）和PE+miR-34b/c antimir组（n=12）。数据显示为平均值±SEM。*p<0.05，*p<0.01，如所示或与对照抗虫药进行比较。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17304.011
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