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.2017年2月28日；8（1）：e00133-17。
doi:10.1128/mBio.00133-17。

建立和维持HIV-1潜伏期需要多种组蛋白赖氨酸甲基转移酶

Kien Nguyen先生 1, Biswajit Das公司 1, 柯蒂斯·多布罗夫斯基 1, 乔纳森·卡恩 2
附属公司

建立和维持HIV-1潜伏期需要多种组蛋白赖氨酸甲基转移酶

阮建元等。 mBio公司. .

摘要

我们之前表明，组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）H3K27me3（EZH2）是Polycomb抑制复合物2（PRC2）的催化亚单位，是维持Jurkat T细胞HIV-1潜伏期所必需的。这里我们通过染色质免疫沉淀实验表明，PRC2和常染色组蛋白赖氨酸N个-甲基转移酶2（EHMT2），即G9a H3K9me2-3甲基转移酶，在前病毒5'长末端重复序列（LTR）高度富集，并在前病毒重新激活后迅速移位。簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）介导的EZH2基因敲除导致EZH2和EHMT2的缺失，但CRISPR-介导的EHMT2基因敲除对EHMT2具有选择性，这与EHMT2敲除在该系统中诱导潜在前病毒的失败一致。（i）在HIV-1感染之前，Jurkat T细胞中的短发夹RNA敲除甲基转移酶，或（ii）用药物抑制酶，显著降低了沉默病毒的水平，证明这两种酶都需要建立潜伏期。令我们惊讶的是，在接受高效抗逆转录病毒治疗的HIV-1感染患者分离出的HIV潜伏期或静息记忆T细胞Th17原代细胞模型中，EZH2（通过GSK-343或EPZ-6438）或EHMT2（通过UNC-0638）的抑制足以诱导潜在前病毒的重新激活。甲基转移酶抑制剂与白介素-15和异丙氧肟酸表现出协同作用。我们的结论是，在原代细胞中建立和维持HIV-1前病毒沉默需要PRC2和EHMT2。此外，EZH2抑制剂如GSK-343和EPZ-6438以及EHMT2抑制剂UNC-0638是临床研究中用作潜伏期逆转剂的有力候选者。重要性高效抗逆转录病毒治疗（HAART）可将循环病毒降低到无法检测到的水平。虽然坚持HAART方案的患者的病毒血症很小，但由于在极少数静息记忆CD4人群中存在潜伏但具有复制能力的前病毒，因此HIV持续存在+T细胞（约1/106单元格）。潜伏期仍然是功能性治愈HIV感染的主要障碍，因为当HAART被中断时，持续性储存几乎总是在2到8周内反弹。在潜在感染细胞中，HIV基因组稳定地整合到宿主染色体中，但由于表观遗传沉默机制，转录受到抑制。我们在此证明，多组蛋白赖氨酸甲基转移酶在从抑制良好的患者获得的细胞中建立和维持前病毒沉默中起着关键作用。抑制这些酶的药物可从肿瘤学应用中获得，并可用于逆转潜伏期，作为水库减少策略的一部分。

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数字

图1
图1
CRISPR介导的EZH2或JARID2缺失可重新激活E4细胞中潜伏的HIV-1。面板：A、EZH2-中断电池；B、 JARID2-分裂细胞；C、 EHMT2（G9a）-破坏细胞。（上图）蛋白质印迹分析显示组蛋白甲基转移酶和甲基化组蛋白。（底部）HIV-1重新激活的量化。E4细胞被靶向所示蛋白的表达CRISPR-Cas9的病毒感染。通过FACS分析，在感染后7天用SAHA（1μM）刺激过夜，检测HIV-1的重新激活。误差条代表三个独立实验的SEM。
图2
图2
CRISPR破坏后组蛋白甲基转移酶和甲基化组蛋白在HIV前病毒上的分布。（A） EZH2和EHMT2中断。（B） JARID2中断。使用HIV LTR和下游区域的引物，对感染CRISPRs的E4细胞进行ChIP分析（27）。HIV DNA水平计算为输入的百分比。误差条表示三个单独实时PCR测量的SEM。
图3
图3
PRC2是HIV-1在Jurkat T细胞中无声整合所必需的。（A） 实验方案。（B） 代表性流量数据测量未处理细胞中表达EZH2或干扰shRNA的细胞中H3K27me3水平和HIV感染。（C） 用1µM SAHA处理的细胞。黑色，每个象限的细胞数；红色，GFP分布+高H3K27me3栅中的电池；蓝色，GFP分布+低H3K27me3栅极中的电池。（D） 靶向PRC2不同亚单位的shRNAs处理的细胞中HIV-1的相对沉默。（顶部）高和低H3K27me3人群中的诱导病毒。（下）每个PRC2亚单位被击倒后的相对沉默。误差条代表三个独立实验的SEM。
图4
图4
组蛋白甲基转移酶抑制剂激活Th17静息记忆T细胞中的HIV-1潜伏前病毒。用显示的GSK-343（A）、EPZ-6438（B）或UNC-0638（C）浓度处理细胞96小时。通过流式细胞术（FACS）检测Nef表达监测的潜伏HIV-1的再激活和磷酸化S175 CDK9水平监测的P-TEFb再激活。
图5
图5
EZH2和EHMT2是在原代Th17细胞中建立潜伏HIV-1所必需的。（A） 实验设计。（B） 用二甲基亚砜、100 nM GSK-343、EPZ-6438或UNC-0638预处理的细胞中，Dynabeads人T激活剂CD3/CD28、IL-15（50 ng/ml）或ConA（5µg/ml）对潜伏前病毒的激活。
图6
图6
CD4中潜伏HIV-1的诱导+组蛋白甲基转移酶抑制剂抑制患者的记忆T细胞。CD4细胞+在IL-15（50 ng/ml）或SAHA（500 nM）存在或不存在的情况下，用100 nM GSK-343、EPZ-6438或UNC-0638处理HIV-1感染患者分离的记忆性T细胞72 h。拼接HIV-1的水平环境价值mRNA通过EDITS下一代测序分析进行测量，并以每10个含有活化HIV-1的细胞数量表示6细胞。
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