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.2017年2月27日：7:43466。
doi:10.1038/srep43466。

通过激活转录因子EB增强溶酶体生物生成和自噬通量，防止镉诱导的神经毒性

会风派 1, 李敏（音） 1, 李天 1, 杨志奇 2 三, 俞正平 1, 周舟 1 4
附属公司

通过激活转录因子EB增强溶酶体生物生成和自噬通量，防止镉诱导的神经毒性

回风皮等。 科学代表. .

摘要

镉（Cd）是一种普遍存在的重金属，是众所周知的神经毒性诱导剂。然而，镉诱导神经毒性的机制尚不清楚。在本研究中，我们发现镉通过降低溶酶体相关膜蛋白水平、抑制溶酶体蛋白水解和改变溶酶体pH值，抑制自噬体-溶酶体融合并损害溶酶体功能，导致自噬清除缺陷，继而导致神经细胞死亡。此外，镉在mRNA和蛋白质水平上降低转录因子EB（TFEB）的表达。此外，镉诱导TFEB的核移位和TFEB靶基因的表达，与溶酶体功能受损或自噬流量受损后的代偿效应相关。值得注意的是，通过Tfeb过度表达恢复溶酶体相关膜蛋白、溶酶体蛋白水解、溶酶体pH值和自噬通量的水平可以防止Cd诱导的神经毒性，这种保护作用不完全依赖于Tfeb核移位。此外，主自噬调节因子TFEB的基因转移可清除有毒蛋白质并纠正体内镉诱导的神经毒性。我们的研究首次证明镉干扰溶酶体功能和自噬流量，操纵TFEB信号可能是对抗镉诱导的神经毒性的治疗方法。

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数字

图1
图1。镉在培养的Neuro-2a细胞中诱导自噬体积累。
(一)Neuro-2a细胞用50 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。(b条)Neuro-2a细胞经50 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。ACTB被用作蛋白质负荷的内部标准。结果以控件的百分比表示。这些值表示为平均值 ± 扫描电镜**p < 0.01与对照组相比。（n个） = 4).
图2
图2。镉抑制培养的Neuro-2a细胞的自噬流量。
(一)Neuro-2a细胞经50 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。ACTB被用作蛋白质负荷的内部标准。(b条)LC3或(c（c）)Neuro-2a细胞经镉（50 μM）在没有或存在CQ（50 μM）24 h.结果表示为与对照相比的折叠变化。数值表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比。（n个） = 4).
图3
图3。镉在培养的Neuro-2a细胞中阻断自噬体-溶酶体融合。
(一)Cd（0或50）后Neuro-2a与抗LAMP1抗体的免疫荧光及与GFP-LC3B斑点共定位 μM）处理24 h；(b条)在使用Premo™自噬串联传感器RFP-GFP-LC3B试剂盒感染Neuro-2a细胞后，用镉（50 μM）24 h.箭头表示LC3和LAMP1之间的协同定位。结果表示为与对照相比的折叠变化。这些值表示为平均值 ± 扫描电镜**p < 0.01与对照组相比。（n个） = 6).
图4
图4。镉损害培养的Neuro-2a细胞的溶酶体功能。
(一)50℃处理的Neuro-2a细胞LAMP1蛋白的代表性western blot和定量分析 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。ACTB被用作蛋白质负荷的内部标准。(b条)50处理的Neuro-2a细胞的DQ-BSA裂解活性 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。(c（c）)用50 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。(d日)用50 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。结果表示为与对照相比的折叠变化。数值表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比。（n个） = 4).
图5
图5。镉降低培养的Neuro-2a细胞中TFEB的表达。
(一)50℃处理的Neuro-2a细胞LAMP1蛋白的代表性western blot和定量分析 微米 不同时间的Cd（0、6、12或24 h） ●●●●。ACTB被用作蛋白质负荷的内部标准。(b条)qRT-PCR分析显示经50 微米 不同时间的Cd（0、6、12、24 h） ●●●●。(c（c）)抗TFEB抗体和DAPI孵育的Neuro-2a细胞在镉（50 μM）治疗24 h；比例尺：20 微米。(d日)用50 微米 24的Cd h.结果表示为与对照相比的折叠变化。这些值表示为平均值 ± 扫描电镜**p < 0.01与对照组相比。（n个） = 6).
图6
图6。的过度表达特菲布在培养的Neuro-2a细胞中减弱Cd抑制溶酶体功能并恢复自噬流量。
用镉（50 μM）转染pEGFP-N1后-特菲布第141a条，pEGFP-N1-特菲布S141D系列和控制质粒。(一)Neuro-2a细胞中LAMP1、LC3和SQSTM1的代表性免疫印迹和定量分析。ACTB被用作蛋白质负荷的内部标准。(b条)抗LC3B和抗LAMP1抗体的Neuro-2a细胞的免疫荧光。箭头表示LC3和LAMP1之间的协同定位；比例尺：2 微米。(c（c）)Neuro-2a细胞的DQ-BSA染色。(d日)Neuro-2a细胞的细胞活力。(e（电子）)测定TFEB靶基因的相对mRNA水平。结果表示为与对照相比的折叠变化。这些值表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比，#第页 < 0.05,##第页 < 0.01与Cd（50 μM）组。（n个） = 6).
图7
图7。TFEB是镉诱导的神经毒性的新治疗靶点体内试验。
特菲布在镉暴露前通过立体定向投放AAV过度表达。免疫荧光分析(一)LC3B表达(b条)SQSTM1表达(c（c）)LAMP1表达和(d日)脑组织尼塞尔染色。左边的面板是高倍图像。结果表示为与对照相比的折叠变化。这些值表示为平均值 ± 扫描电镜**p < 0.01与对照组相比，#p < 0.05,##第页 < 0.01与镉组相比。（n个） = 12~15).
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