跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年6月：50:53-76。
doi:10.1016/j.exphem.2017.02.001。 Epub 2017年2月21日。

真性红细胞增多症中JAK2V617F损害了人应激性红细胞生成的钙网蛋白控制

马里奥·法尔基 1, 莉莲·瓦里奇奥 2, 法布里奇奥·马泰利 三, 曼努埃拉·马拉 三, 奥里埃塔·皮科尼 1, 阿戈斯蒂诺·塔夫里 4, 加布里埃拉·吉雷利 5, 弗拉基米尔·努夫斯基 6, 安娜·丽塔·米利亚乔 7
附属公司

真性红细胞增多症中JAK2V617F损害了人应激性红细胞生成的钙网蛋白控制

马里奥·法尔基等。 实验血醇. 2017年6月.

摘要

钙网蛋白（CALR）是一种钙2+-结合蛋白，与与N/P结构域结合的蛋白质在细胞间穿梭。激活人促红细胞生成素受体诱导钙2+通量促使我们研究CALR在人类红细胞生成中的作用。如Western blot分析所示，从正常来源和JAK2V617F真性红细胞增多症（PV）患者体外生成的成红细胞表达稳定的CALR水平。然而，Ca2+仅在正常细胞中调节CALR构象。正常红细胞主要在其细胞表面（如流式细胞术所示）表达CALR的N末端结构域（N-CALR），在其细胞质（如共焦显微镜所示）中表达C末端结构域，并且这两个表位的表达随着成熟而降低。在原红细胞（proEry）细胞质中，C-CALR与启动应激反应的糖皮质激素受体（GR）相关。在这些细胞中，钙2+剥夺和抑制核输出增加了GR核定位，同时减少了C-CALR和C-CALR/GR关联和增殖的细胞质检测，以应对GR激动剂地塞米松（Dex）。钙反而增加了C-CALR/GR相关性和Dex反应性2+和促红细胞生成素。相反，JAK2V617F探针表达正常的N-CALR细胞表面水平，但几乎检测不到C-CALR细胞质水平。这些细胞主要在细胞核内含有GR，且Dex无反应。Ruxolitinib挽救了JAK2V617F原Erys中C-CALR、C-CALR/GR关联和Dex反应性的细胞质检测，其作用被核输出和Ca拮抗2+通量抑制剂。这些结果表明2+-CALR诱导的构象变化调节正常红细胞GR的核输出，JAK2V617F解除了PV的这一功能。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突披露

作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1
钙的存在2+溶液中影响从正常来源的跨国公司检测N-CALR，但不影响从JAK2号机组V617F-光伏。（A）对来自7名正常献血者（NS）和12名健康献血者的MNC的N-CALR、C-CALR，磷酸化形式的p38（pp38）和p38（作为疾病特异性控制）以及GAPDH（作为负荷控制）的抗体进行WB分析JAK2号机组+-本研究调查了PV患者（每条线为不同的受试者）。含有0.9 mmol/L Ca的裂解缓冲液2+.（B）关于GAPDH的N-CALR、C-CALR，pp38和p38的含量以及来自NS的跨国公司中pp38/p38比率的量化（开环，n个=7）或JAK2号机组+-PV（开放三角形，n个= 12). 结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）（闭合圆）。第页通过方差分析计算值。（C）用一个NS和两个NS的MNC裂解物的N-CALR、C-CALR和GAPDH特异性抗体进行WB分析JAK2号机组+-含有0.9或10 mmol/L Ca的PV患者2+，如图所示。
图2
图2
来自PV的跨国公司在含有或不含Dex的培养物中产生大量未成熟Erys，这些细胞对Dex过敏。（A）如图所示，NS或PV受试者的跨国公司在有或无Dex刺激的HEMA培养物中，第10天产生的细胞数量（随着倍数的增加）。具有和不具有Dex的NS跨国公司生成的细胞数量在统计学上存在差异（通过方差分析），而PV跨国公司获得的细胞数量则没有差异。总体而言，光伏跨国公司产生的电池数量是NS跨国公司产生电池数量的三倍(第页= 0.021). 每组中的受试者人数由n个更多细节请参见图1B的图例。（B）第10天在NS MNC培养基中获得的细胞CD36和CD235a表达的代表性流式细胞术分析JAK2号机组+-有无债务的光伏跨国公司。根据CD36模式的标准标准，将燕麦划分为不同的成熟阶段销售时点情报系统/CD235a型否定表达以矩形表示（proErys，紫色；嗜碱性Erys，红色；多色Erys，深绿色；正色Eries，蓝色）[26,29]。矩形附近的数字表示不同种群的频率。非荧光用绿点表示。这个门控在整个手稿中都有颜色编码。（C）具有代表性的May–Grunwald染色法，对第10天在NS或JAK2号机组+-如图所示，具有和不具有Dex的PV MNCs。原稿放大200倍。（D）来自NS的HEMA培养物中第10天产生的Erys的短期（24小时）增殖(n个=6，开圆圈）和JAK2号机组+-光伏(n个=10，开放三角形），以响应有或无Dex（10）的GFs（SCF、IL-3和EPO−6mmol/L）和添加或不添加GR抑制剂RU486（50μmol/L），如图所示。一些实验是重复进行的。这项研究以及另一项研究是在含有FBS的培养基中进行的，通过木炭处理去除了糖皮质激素。结果以单个数据点和平均值（±SEM）表示。数据通过方差分析和第页显示了组之间的值。（在线提供彩色版本。）
图3
图3
Erys生成自JAK2号机组+-PV表达正常水平的CALR，但来自这些细胞的CARR对钙诱导的构象变化不敏感2+.（A）从NS或PV获得的Erys的GRα、C-CALR和N-CALR的代表性WB分析（每行为不同的供体）。GAPDH被分析为负荷控制。预期分子量显示在左侧。含有10 mmol/L Ca的裂解物2+.（B）来自NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR相对于GAPDH的单个数据点和平均（±SEM）含量(n个=10，开圆圈）和JAK2号机组+-光伏(n个=10，开放三角形）。结果表示为每个波段的密度值与相应GAPDH的密度值之比，并表示为单个数据点（一些数据点重叠）和平均值（±SEM）。（C）用一个NS和一个NS的Erys裂解产物的N-CALR、C-CALR和GAPDH特异性抗体进行WB分析JAK2号机组+-PV患者。用0.9或10 mmol/L Ca补充裂解产物2+，如图所示。巨核细胞性-红白血病JAK2号机组−-K562和JAK2号机组+-HEL细胞系作为对照进行平行分析。（D）来自一个NS和一个NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR半衰期分析的代表性WBJAK2号机组+-如图所示，PV患者与环己酰亚胺孵育0–24小时。右侧的面板显示了不同组中GRα（黑线）、N-CALR（红线）和C-CALR的量化。结果显示为GAPDH相对表达相对于时间0时相对表达的倍数变化，并表示为每组三个不同实验中所得结果的平均值（±SD）。水平线表示50%的减少水平*数值在统计上不同(第页<0.05（方差分析）。（E）为了评估环己酰亚胺处理是否影响N-CALR的表观分子量（D）在含有10%丙烯酰胺的SDS-PAGE上重复运行，该丙烯酰胺将55KDa区域与较高的严格性分开。将凝胶进行印迹，将硝化纤维素膜切成两部分，分别与N-CALR和C-CALR特异性抗体杂交。然后对这两部分进行重新对准，并通过长期接触增强子显影剂（以增加低丰度带的信号）来显示信号。N-CALR和C-CALR均为一条带。此外，在用环己酰亚胺处理24小时的Erys中，N-CALR带的迁移没有差异（在该带中几乎检测不到），而在未处理的Erys上，C-CALR的迁移也没有差异（其表达最大水平的N-CARR）。这些结果表明，放线菌酮处理24小时后观察到的N-CALR信号的减少不是由于蛋白质降解。（F）量化NS中Erys的GRα、N-CALR和C-CALR（蓝色条）或JAK2号机组+-用选择性细胞内钙预处理的PV患者（红条）2+螯合剂BAPTA（10μmol/L）[32]与提高细胞内钙水平的化合物结合2+，Io（1μmol/L），持续4小时。根据相应的GAPDH对感兴趣的蛋白质进行量化，然后将结果表示为与用培养基预处理的相应Erys中观察到的相对含量。结果以个人数据点和每组三个独立供体观察到的平均值（±SEM）表示。BAPTA与钙抑制剂联合处理Erys也获得了类似的结果2+在ER中，TG（1μmol/L）（数据未显示）。（G）体内钙抑制效应的代表性WB测定2+N-CALR和C-CALR在Erys中半衰期的通量JAK2号机组+-PV患者。钙2+如前所述，通过将细胞与BAPTA和碘或甘油三酯预孵育4小时，通量受到抑制[16]。由于在暴露于钙抑制剂的Erys中观察到大量成熟，12小时后停止了时间进程分析2+通量为16-24小时。（H）来自NS和JAK2号机组+-PV单独用介质（直线）、Io+BAPTA（虚线）或TG+BAPTA（虚线。结果显示为三个实验的平均值（±SEM）。面板D和G了解更多细节。（在线提供彩色版本。）
图3
图3
Erys生成自JAK2号机组+-PV表达正常水平的CALR，但来自这些细胞的CARR对钙诱导的构象变化不敏感2+.（A）从NS或PV获得的Erys的GRα、C-CALR和N-CALR的代表性WB分析（每行为不同的供体）。GAPDH被分析为负荷控制。预期分子量显示在左侧。含有10 mmol/L Ca的裂解物2+.（B）来自NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR相对于GAPDH的单个数据点和平均（±SEM）含量(n个=10，开圆圈）和JAK2号机组+-光伏(n个=10，开放三角形）。结果表示为每个波段的密度值与相应GAPDH的密度值之比，并表示为单个数据点（一些数据点重叠）和平均值（±SEM）。（C）用一个NS和一个NS的Erys裂解产物的N-CALR、C-CALR和GAPDH特异性抗体进行WB分析JAK2号机组+-PV患者。用0.9或10 mmol/L Ca补充裂解产物2+，如图所示。巨核细胞性-红白血病JAK2号机组−-K562和JAK2号机组+-HEL细胞系作为对照进行平行分析。（D）来自一个NS和一个NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR半衰期分析的代表性WBJAK2号机组+-如图所示，PV患者与环己酰亚胺孵育0–24小时。右侧的面板显示了不同组中GRα（黑线）、N-CALR（红线）和C-CALR的量化。结果显示为GAPDH相对表达相对于时间0时相对表达的倍数变化，并表示为每组三个不同实验中所得结果的平均值（±SD）。水平线表示50%的减少水平*数值在统计上不同(第页<0.05（方差分析）。（E）为了评估环己酰亚胺处理是否影响N-CALR的表观分子量（D）在含有10%丙烯酰胺的SDS-PAGE上重复运行，该丙烯酰胺将55KDa区域与较高的严格性分开。将凝胶进行印迹，将硝化纤维素膜切成两部分，分别与N-CALR和C-CALR特异性抗体杂交。然后对这两部分进行重新对准，并通过长期接触增强子显影剂（以增加低丰度带的信号）来显示信号。N-CALR和C-CALR均为一条带。此外，在用环己酰亚胺处理24小时的Erys中，N-CALR带的迁移没有差异（在该带中几乎检测不到），而在未处理的Erys上，C-CALR的迁移也没有差异（其表达最大水平的N-CARR）。这些结果表明，放线菌酮处理24小时后观察到的N-CALR信号的减少不是由于蛋白质降解。（F）量化NS中Erys的GRα、N-CALR和C-CALR（蓝色条）或JAK2号机组+-用选择性细胞内钙预处理的PV患者（红条）2+螯合剂BAPTA（10μmol/L）[32]与提高细胞内钙水平的化合物结合2+，Io（1μmol/L），持续4小时。根据相应的GAPDH对感兴趣的蛋白质进行量化，然后将结果表示为与用培养基预处理的相应Erys中观察到的相对含量。结果以个人数据点和每组三个独立供体观察到的平均值（±SEM）表示。BAPTA与钙抑制剂联合处理Erys也获得了类似的结果2+在ER中，TG（1μmol/L）（数据未显示）。（G）体内钙抑制效应的代表性WB测定2+N-CALR和C-CALR在Erys中半衰期的通量JAK2号机组+-PV患者。钙2+如前所述，通过将细胞与BAPTA和碘或甘油三酯预孵育4小时，通量受到抑制[16]。由于在暴露于钙抑制剂的Erys中观察到大量成熟，12小时后停止了时间进程分析2+通量为16-24小时。（H）来自NS和JAK2号机组+-PV单独用介质（直线）、Io+BAPTA（虚线）或TG+BAPTA（虚线。结果显示为三个实验的平均值（±SEM）。面板D和G了解更多细节。（在线提供彩色版本。）
图3
图3
Erys生成自JAK2号机组+-PV表达正常水平的CALR，但来自这些细胞的CARR对钙诱导的构象变化不敏感2+.（A）从NS或PV获得的Erys的GRα、C-CALR和N-CALR的代表性WB分析（每行为不同的供体）。GAPDH被分析为负荷控制。预期分子量显示在左侧。含有10 mmol/L Ca的裂解物2+.（B）来自NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR相对于GAPDH的单个数据点和平均（±SEM）含量(n个=10，开圆圈）和JAK2号机组+-光伏(n个=10，开放三角形）。结果表示为每个波段的密度值与相应GAPDH的密度值之比，并表示为单个数据点（一些数据点重叠）和平均值（±SEM）。（C）用一个NS和一个NS的Erys裂解产物的N-CALR、C-CALR和GAPDH特异性抗体进行WB分析JAK2号机组+-PV患者。用0.9或10 mmol/L Ca补充裂解产物2+，如图所示。巨核细胞性-红白血病JAK2号机组−-K562和JAK2号机组+-HEL细胞系作为对照进行平行分析。（D）来自一个NS和一个NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR半衰期分析的代表性WBJAK2号机组+-如图所示，PV患者与环己酰亚胺孵育0–24小时。右侧的面板显示了不同组中GRα（黑线）、N-CALR（红线）和C-CALR的量化。结果显示为GAPDH相对表达相对于时间0时相对表达的倍数变化，并表示为每组三个不同实验中所得结果的平均值（±SD）。水平线表示50%的减少水平*数值在统计上不同(第页<0.05（方差分析）。（E）为了评估环己酰亚胺处理是否影响N-CALR的表观分子量（D）在含有10%丙烯酰胺的SDS-PAGE上重复运行，该丙烯酰胺将55KDa区域与较高的严格性分开。将凝胶进行印迹，将硝化纤维素膜切成两部分，分别与N-CALR和C-CALR特异性抗体杂交。然后对这两部分进行重新对准，并通过长期接触增强子显影剂（以增加低丰度带的信号）来显示信号。N-CALR和C-CALR均为一条带。此外，在用环己酰亚胺处理24小时的Erys中，N-CALR带的迁移没有差异（在该带中几乎检测不到），而在未处理的Erys上，C-CALR的迁移也没有差异（其表达最大水平的N-CARR）。这些结果表明，放线菌酮处理24小时后观察到的N-CALR信号的减少不是由于蛋白质降解。（F）量化NS中Erys的GRα、N-CALR和C-CALR（蓝色条）或JAK2号机组+-用选择性细胞内钙预处理的PV患者（红条）2+螯合剂BAPTA（10μmol/L）[32]与提高细胞内钙水平的化合物结合2+，Io（1μmol/L），持续4小时。根据相应的GAPDH对感兴趣的蛋白质进行量化，然后将结果表示为与用培养基预处理的相应Erys中观察到的相对含量。结果以个人数据点和每组三个独立供体观察到的平均值（±SEM）表示。BAPTA与钙抑制剂联合处理Erys也获得了类似的结果2+在ER中，TG（1μmol/L）（数据未显示）。（G）体内钙抑制效应的代表性WB测定2+N-CALR和C-CALR在Erys中半衰期的通量JAK2号机组+-PV患者。钙2+如前所述，通过将细胞与BAPTA和碘或甘油三酯预孵育4小时，通量受到抑制[16]。由于在暴露于钙抑制剂的Erys中观察到大量成熟，12小时后停止了时间进程分析2+通量为16-24小时。（H）来自NS和JAK2号机组+-PV单独用介质（直线）、Io+BAPTA（虚线）或TG+BAPTA（虚线。结果显示为三个实验的平均值（±SEM）。面板D和G了解更多细节。（在线提供彩色版本。）
图3
图3
Erys生成自JAK2号机组+-PV表达正常水平的CALR，但来自这些细胞的CARR对钙诱导的构象变化不敏感2+.（A）从NS或PV获得的Erys的GRα、C-CALR和N-CALR的代表性WB分析（每行为不同的供体）。GAPDH被分析为负荷控制。预期分子量显示在左侧。含有10 mmol/L Ca的裂解物2+.（B）来自NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR相对于GAPDH的单个数据点和平均（±SEM）含量(n个=10，开圆圈）和JAK2号机组+-光伏(n个=10，开放三角形）。结果表示为每个波段的密度值与相应GAPDH的密度值之比，并表示为单个数据点（一些数据点重叠）和平均值（±SEM）。（C）用一个NS和一个NS的Erys裂解产物的N-CALR、C-CALR和GAPDH特异性抗体进行WB分析JAK2号机组+-PV患者。用0.9或10 mmol/L Ca补充裂解产物2+，如图所示。巨核细胞性-红白血病JAK2号机组−-K562和JAK2号机组+-HEL细胞系作为对照进行平行分析。（D）来自一个NS和一个NS的Erys中GRα、N-CALR和C-CALR半衰期分析的代表性WBJAK2号机组+-如图所示，PV患者与环己酰亚胺孵育0–24小时。右侧的面板显示了不同组中GRα（黑线）、N-CALR（红线）和C-CALR的量化。结果显示为GAPDH相对表达相对于时间0时相对表达的倍数变化，并表示为每组三个不同实验中所得结果的平均值（±SD）。水平线表示50%的减少水平*数值在统计上不同(第页<0.05（方差分析）。（E）为了评估环己酰亚胺处理是否影响N-CALR的表观分子量（D）在含有10%丙烯酰胺的SDS-PAGE上重复运行，该丙烯酰胺将55KDa区域与较高的严格性分开。将凝胶进行印迹，将硝化纤维素膜切成两部分，分别与N-CALR和C-CALR特异性抗体杂交。然后对这两部分进行重新对准，并通过长期接触增强子显影剂（以增加低丰度带的信号）来显示信号。N-CALR和C-CALR均为一条带。此外，在用环己酰亚胺处理24小时的Erys中，N-CALR带的迁移没有差异（在该带中几乎检测不到），而在未处理的Erys上，C-CALR的迁移也没有差异（其表达最大水平的N-CARR）。这些结果表明，放线菌酮处理24小时后观察到的N-CALR信号的减少不是由于蛋白质降解。（F）量化NS中Erys的GRα、N-CALR和C-CALR（蓝色条）或JAK2号机组+-用选择性细胞内钙预处理的PV患者（红条）2+螯合剂BAPTA（10μmol/L）[32]与提高细胞内钙水平的化合物结合2+，Io（1μmol/L），持续4小时。根据相应的GAPDH对感兴趣的蛋白质进行量化，然后将结果表示为与用培养基预处理的相应Erys中观察到的相对含量。结果以个人数据点和每组三个独立供体观察到的平均值（±SEM）表示。BAPTA与钙抑制剂联合处理Erys也获得了类似的结果2+在ER中，TG（1μmol/L）（数据未显示）。（G）体内钙抑制效应的代表性WB测定2+N-CALR和C-CALR在Erys中半衰期的通量JAK2号机组+-PV患者。钙2+如前所述，通过将细胞与BAPTA和碘或甘油三酯预孵育4小时，通量受到抑制[16]。由于在暴露于钙抑制剂的Erys中观察到大量成熟，12小时后停止了时间进程分析2+通量为16-24小时。（H）来自NS和JAK2号机组+-PV单独用介质（直线）、Io+BAPTA（虚线）或TG+BAPTA（虚线。结果显示为三个实验的平均值（±SEM）。面板D和G了解更多细节。（在线提供彩色版本。）
图4
图4
N-CALR是细胞表面暴露最多的表位，其表达受来自NS的Erys中GFs的上调。相反，N-CALR在Erys中高水平表达JAK2号机组+-PV独立于刺激。（A）代表性流式细胞术测定NS和Erys细胞表面C-CALR和N-CALR的表达JAK2号机组+-光伏。如图2B所示，燕麦被划分为不同的成熟阶段。绿色直方图表示具有代表性的同种型对照。直方图中的数字表示CALR信号的平均荧光强度（MFI）。结果代表了不同捐赠者的观察结果。每组中的捐赠者数量如下所示n个.（B）N-CALR水平由顶部直方图所示的不同类别表示。结果表示为单个数据点，以及使用NS和JAK2号机组+-光伏探头，如图所示*数值在统计上不同(第页方差分析（ANOVA）<0.01）。（C）NS和JAK2号机组+-PV MPN暴露于Dex、EPO和SCF 15分钟4小时，如图所示。结果以单个数据点和每组三个不同实验中观察到的结果的平均值（±SEM）表示，每个实验由不同的供体进行，一式两份。采用方差分析进行统计分析，显著性第页值显示在面板中。（在线提供彩色版本。）
图5
图5
C-CALR是正常Erys细胞质中暴露最多的表位，其表达随着成熟而降低。（A）如图所示，从NS中获得的代表性共焦显微镜下N-CALR和C-CALR染色探针（红色信号）。细胞也暴露于GR抗体（绿色），细胞核用DAPI进行复染。对有和无Triton渗透的细胞进行分析，以分别突出细胞表面和细胞内蛋白质含量。透化缓冲液含有0.9 mmol/L Ca2+或无，如图所示。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）在第10天用C-CALR抗体染色的NS培养物中获得的具有代表性的渗透性原细胞和原细胞的共焦显微镜（红色信号）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。成熟状态按大小识别[29]。原始放大倍数1500×。（C）NS的一个代表性探针中单个和合并共焦GR（绿色）和C-CALR（红色）信号的详细信息。插入物在更高的放大倍数下详细说明了核（DAPI，蓝色）和C-CALR（红色）信号之间的边界。原始放大倍数3000倍（另见电影1和2）。（D）来自附加NS实验的探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）（顶部面板）或C-CALR-（红色）及Lamin B1（绿色）信号（中间和底部面板）的详细信息。在这个实验中，细胞被固定在甲醇中以保持核膜的完整性。细胞核用DAPI染色（蓝色）。由于拉明B1标记核膜内侧[50]，C-CALR和拉明B1信号缺乏共定位，证实GR/C–CALR关联发生在与细胞核交界的细胞质中。原始放大倍数1500×。不显示比例尺。
图5
图5
C-CALR是正常Erys细胞质中暴露最多的表位，其表达随着成熟而降低。（A）如图所示，从NS中获得的代表性共焦显微镜下N-CALR和C-CALR染色探针（红色信号）。细胞也暴露于GR抗体（绿色），细胞核用DAPI进行复染。对有和无Triton渗透的细胞进行分析，以分别突出细胞表面和细胞内蛋白质含量。透化缓冲液含有0.9 mmol/L Ca2+或无，如图所示。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）在第10天用C-CALR抗体染色的NS培养物中获得的具有代表性的渗透性原细胞和原细胞的共焦显微镜（红色信号）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。成熟状态按大小识别[29]。原始放大倍数1500×。（C）NS的一个代表性探针中单个和合并共焦GR（绿色）和C-CALR（红色）信号的详细信息。插入物在更高的放大倍数下详细说明了核（DAPI，蓝色）和C-CALR（红色）信号之间的边界。原始放大倍数3000倍（另见电影1和2）。（D）来自附加NS实验的探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）（顶部面板）或C-CALR-（红色）及Lamin B1（绿色）信号（中间和底部面板）的详细信息。在这个实验中，细胞被固定在甲醇中以保持核膜的完整性。细胞核用DAPI染色（蓝色）。由于拉明B1标记核膜内侧[50]，C-CALR和拉明B1信号缺乏共定位，证实GR/C–CALR关联发生在与细胞核交界的细胞质中。原始放大倍数1500×。不显示比例尺。
图5
图5
C-CALR是正常Erys细胞质中暴露最多的表位，其表达随着成熟而降低。（A）如图所示，从NS中获得的代表性共焦显微镜下N-CALR和C-CALR染色探针（红色信号）。细胞也暴露于GR抗体（绿色），细胞核用DAPI进行复染。对有和无Triton渗透的细胞进行分析，以分别突出细胞表面和细胞内蛋白质含量。透化缓冲液含有0.9 mmol/L Ca2+或无，如图所示。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）在第10天用C-CALR抗体染色的NS培养物中获得的具有代表性的渗透性原细胞和原细胞的共焦显微镜（红色信号）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。成熟状态按大小识别[29]。原始放大倍数1500×。（C）NS的一个代表性探针中单个和合并共焦GR（绿色）和C-CALR（红色）信号的详细信息。插入物在更高的放大倍数下详细说明了核（DAPI，蓝色）和C-CALR（红色）信号之间的边界。原始放大倍数3000倍（另见电影1和2）。（D）来自附加NS实验的探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）（顶部面板）或C-CALR-（红色）及Lamin B1（绿色）信号（中间和底部面板）的详细信息。在这个实验中，细胞被固定在甲醇中以保持核膜的完整性。细胞核用DAPI染色（蓝色）。由于拉明B1标记核膜内侧[50]，C-CALR和拉明B1信号缺乏共定位，证实GR/C–CALR关联发生在与细胞核交界的细胞质中。原始放大倍数1500×。不显示比例尺。
图5
图5
C-CALR是正常Erys细胞质中暴露最多的表位，其表达随着成熟而降低。（A）如图所示，从NS中获得的代表性共焦显微镜下N-CALR和C-CALR染色探针（红色信号）。细胞也暴露于GR抗体（绿色），细胞核用DAPI进行复染。对有和无Triton渗透的细胞进行分析，以分别突出细胞表面和细胞内蛋白质含量。透化缓冲液含有0.9 mmol/L Ca2+或无，如图所示。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）在第10天用C-CALR抗体染色的NS培养物中获得的具有代表性的渗透性原细胞和原细胞的共焦显微镜（红色信号）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。成熟状态按大小识别[29]。原始放大倍数1500×。（C）NS的一个代表性探针中单个和合并共焦GR（绿色）和C-CALR（红色）信号的详细信息。插入物在更高的放大倍数下详细说明了核（DAPI，蓝色）和C-CALR（红色）信号之间的边界。原始放大倍数3000倍（另见电影1和2）。（D）来自附加NS实验的探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）（顶部面板）或C-CALR-（红色）及Lamin B1（绿色）信号（中间和底部面板）的详细信息。在这个实验中，细胞被固定在甲醇中以保持核膜的完整性。细胞核用DAPI染色（蓝色）。由于拉明B1标记核膜内侧[50]，C-CALR和拉明B1信号缺乏共定位，证实GR/C–CALR关联发生在与细胞核交界的细胞质中。原始放大倍数1500×。不显示比例尺。
图6
图6
Erys来自JAK2号机组+-PV在细胞质中不含可检测到的C-CALR水平，GR主要在细胞核中表达。（A）在第10天在培养物中获得的具有对一种代表性proEry的C-CALR（红色）和GR（绿色）特异性抗体的共焦显微镜的单个和合并图像JAK2号机组+-PV（图2-4中分析的相同培养物）。用DAPI对细胞核进行复染。来自的探针JAK2号机组+-未检测到PV、C-CALR，GR主要在细胞核中检测到。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）在来自多个NS的探针中观察到的总（GR）和核（GR-nucl）GR、总C-CALR和CALR/GR共定位（coloc）信号的量化(n个=3）和JAK2号机组+-光伏(n个=3）每个实验点共16个细胞的实验。结果显示为每个实验点15–26个细胞所得结果的方框图（中位数±第一和第三四分位数，晶须最大值和最小值中的较小值）。右边的表格总结了各组之间在统计上的显著差异。
图6
图6
Erys来自JAK2号机组+-PV在细胞质中不含可检测到的C-CALR水平，GR主要在细胞核中表达。（A）在第10天在培养物中获得的具有对一种代表性proEry的C-CALR（红色）和GR（绿色）特异性抗体的共焦显微镜的单个和合并图像JAK2号机组+-PV（图2-4中分析的相同培养物）。用DAPI对细胞核进行复染。来自的探针JAK2号机组+-未检测到PV、C-CALR，GR主要在细胞核中检测到。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）在来自多个NS的探针中观察到的总（GR）和核（GR-nucl）GR、总C-CALR和CALR/GR共定位（coloc）信号的量化(n个=3）和JAK2号机组+-光伏(n个=3）每个实验点共16个细胞的实验。结果显示为每个实验点15–26个细胞所得结果的方框图（中位数±第一和第三四分位数，晶须最大值和最小值中的较小值）。右边的表格总结了各组之间在统计上的显著差异。
图7
图7
在正常探针中，C-CALR的细胞质检测及其与GR的关联性被Dex降低，而EPO增加，而这些操作对来自JAK2号机组+-光伏。（A）从NS（左）或JAK2号机组+-PV患者（右）。细胞在含有10%煤焦处理过的FBS的培养基中接受GFD 4小时，然后用Dex、EPO和SCF单独或联合刺激15分钟或4小时，如图所示。GAPDH被分析为负载控制。（B）从NS中获得的Erys的细胞质和细胞核部分的GRα（总的和在S211磷酸化的）、N-CALR和C-CALR的WB分析。在实验1中，细胞被GFD刺激4小时，然后用Dex单独或与RU486联合刺激15分钟。Lamin B1（LamB1）是核馏分的负荷控制。在实验2中，对细胞进行分析（增殖n个=Prol）或GFD后，然后用Dex、EPO、Dex+EPO、SCF或SCF+Dex治疗4小时，如图所示。蓝色和红色箭头分别表示GRα水平低于或高于GFD细胞中观察到的水平。HSP90和Lamin B1分别作为细胞质和细胞核部分的负荷控制进行分析。（C）Erys细胞质和核组分GRα和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-光伏。对细胞进行GFD，然后用SCF刺激15分钟或2小时。分析Lamin B1作为负荷控制。分析未经处理细胞的总裂解物（T）作为对照。（D）来自NS和JAK2号机组+-PV，如图所示。在GFD和Dex、EPO或SCF暴露15分钟和4小时后对细胞进行分析。分别用C-CALR和GR抗体获得红色和绿色信号。细胞核用DAPI染色。相同的细胞在（B）和（C）.原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E、F）Dex、EPO或SCF治疗4小时对NS患者GR和C-CALR共定位的影响（E）或JAK2号机组+-光伏。（F）如图所示，显示了与抗GR（绿色）和抗C-CALR（红色）抗体孵育的渗透性探针的单色和合并彩色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数2000×。（G）共聚焦显微镜在NS和GR探针中观察到的单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于不同的操作中。每项实验均一式三份，结果以方框图的形式显示，这些方框图是用24-39个NS细胞和5-10个NS细胞获得的结果JAK2号机组+-每个实验点的光伏电池。这些表格总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（在线提供彩色版本。）
图7
图7
在正常探针中，C-CALR的细胞质检测及其与GR的关联性被Dex降低，而EPO增加，而这些操作对来自JAK2号机组+-光伏。（A）从NS（左）或JAK2号机组+-PV患者（右）。细胞在含有10%煤焦处理过的FBS的培养基中接受GFD 4小时，然后用Dex、EPO和SCF单独或联合刺激15分钟或4小时，如图所示。GAPDH被分析为负载控制。（B）从NS中获得的Erys的细胞质和细胞核部分的GRα（总的和在S211磷酸化的）、N-CALR和C-CALR的WB分析。在实验1中，细胞被GFD刺激4小时，然后用Dex单独或与RU486联合刺激15分钟。Lamin B1（LamB1）是核馏分的负荷控制。在实验2中，对细胞进行分析（增殖n个=Prol）或GFD后，然后用Dex、EPO、Dex+EPO、SCF或SCF+Dex治疗4小时，如图所示。蓝色和红色箭头分别表示GRα水平低于或高于GFD细胞中观察到的水平。HSP90和Lamin B1分别作为细胞质和细胞核部分的负荷控制进行分析。（C）Erys细胞质和核组分GRα和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-光伏。对细胞进行GFD，然后用SCF刺激15分钟或2小时。分析Lamin B1作为负荷控制。分析未经处理细胞的总裂解物（T）作为对照。（D）来自NS和JAK2号机组+-PV，如图所示。在GFD和Dex、EPO或SCF暴露15分钟和4小时后对细胞进行分析。分别用C-CALR和GR抗体获得红色和绿色信号。细胞核用DAPI染色。相同的细胞在（B）和（C）.原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E、F）Dex、EPO或SCF治疗4小时对NS患者GR和C-CALR共定位的影响（E）或JAK2号机组+-光伏。（F）如图所示，显示了与抗GR（绿色）和抗C-CALR（红色）抗体孵育的渗透性探针的单色和合并彩色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数2000×。（G）共聚焦显微镜在NS和GR探针中观察到的单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于不同的操作中。每项实验均一式三份，结果以方框图的形式显示，这些方框图是用24-39个NS细胞和5-10个NS细胞获得的结果JAK2号机组+-每个实验点的光伏电池。这些表格总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（在线提供彩色版本。）
图7
图7
在正常探针中，C-CALR的细胞质检测及其与GR的关联性被Dex降低，而EPO增加，而这些操作对来自JAK2号机组+-光伏。（A）从NS（左）或JAK2号机组+-PV患者（右）。细胞在含有10%煤焦处理过的FBS的培养基中接受GFD 4小时，然后用Dex、EPO和SCF单独或联合刺激15分钟或4小时，如图所示。GAPDH被分析为负载控制。（B）从NS中获得的Erys的细胞质和细胞核部分的GRα（总的和在S211磷酸化的）、N-CALR和C-CALR的WB分析。在实验1中，细胞被GFD刺激4小时，然后用Dex单独或与RU486联合刺激15分钟。Lamin B1（LamB1）是核馏分的负荷控制。在实验2中，对细胞进行分析（增殖n个=Prol）或GFD后，然后用Dex、EPO、Dex+EPO、SCF或SCF+Dex治疗4小时，如图所示。蓝色和红色箭头分别表示GRα水平低于或高于GFD细胞中观察到的水平。HSP90和Lamin B1分别作为细胞质和细胞核部分的负荷控制进行分析。（C）Erys细胞质和核组分GRα和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-光伏。对细胞进行GFD，然后用SCF刺激15分钟或2小时。分析Lamin B1作为负荷控制。分析未经处理细胞的总裂解物（T）作为对照。（D）来自NS和JAK2号机组+-PV，如图所示。在GFD和Dex、EPO或SCF暴露15分钟和4小时后对细胞进行分析。分别用C-CALR和GR抗体获得红色和绿色信号。细胞核用DAPI染色。相同的细胞在（B）和（C）.原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E、F）Dex、EPO或SCF治疗4小时对NS患者GR和C-CALR共定位的影响（E）或JAK2号机组+-光伏。（F）如图所示，显示了与抗GR（绿色）和抗C-CALR（红色）抗体孵育的渗透性探针的单色和合并彩色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数2000×。（G）共聚焦显微镜在NS和GR探针中观察到的单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于不同的操作中。每项实验均一式三份，结果以方框图的形式显示，这些方框图是用24-39个NS细胞和5-10个NS细胞获得的结果JAK2号机组+-每个实验点的光伏电池。这些表格总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（在线提供彩色版本。）
图7
图7
在正常探针中，C-CALR的细胞质检测及其与GR的关联性被Dex降低，而EPO增加，而这些操作对来自JAK2号机组+-光伏。（A）从NS（左）或JAK2号机组+-PV患者（右）。细胞在含有10%煤焦处理过的FBS的培养基中接受GFD 4小时，然后用Dex、EPO和SCF单独或联合刺激15分钟或4小时，如图所示。GAPDH被分析为负载控制。（B）从NS中获得的Erys的细胞质和细胞核部分的GRα（总的和在S211磷酸化的）、N-CALR和C-CALR的WB分析。在实验1中，细胞被GFD刺激4小时，然后用Dex单独或与RU486联合刺激15分钟。Lamin B1（LamB1）是核馏分的负荷控制。在实验2中，对细胞进行分析（增殖n个=Prol）或GFD后，然后用Dex、EPO、Dex+EPO、SCF或SCF+Dex治疗4小时，如图所示。蓝色和红色箭头分别表示GRα水平低于或高于GFD细胞中观察到的水平。HSP90和Lamin B1分别作为细胞质和细胞核部分的负荷控制进行分析。（C）Erys细胞质和核组分GRα和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-光伏。对细胞进行GFD，然后用SCF刺激15分钟或2小时。分析Lamin B1作为负荷控制。分析未经处理细胞的总裂解物（T）作为对照。（D）来自NS和JAK2号机组+-PV，如图所示。在GFD和Dex、EPO或SCF暴露15分钟和4小时后对细胞进行分析。分别用C-CALR和GR抗体获得红色和绿色信号。细胞核用DAPI染色。相同的细胞在（B）和（C）.原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E、F）Dex、EPO或SCF治疗4小时对NS患者GR和C-CALR共定位的影响（E）或JAK2号机组+-光伏。（F）如图所示，显示了与抗GR（绿色）和抗C-CALR（红色）抗体孵育的渗透性探针的单色和合并彩色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数2000×。（G）共聚焦显微镜在NS和GR探针中观察到的单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于不同的操作中。每项实验均一式三份，结果以方框图的形式显示，这些方框图是用24-39个NS细胞和5-10个NS细胞获得的结果JAK2号机组+-每个实验点的光伏电池。这些表格总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（在线提供彩色版本。）
图7
图7
在正常探针中，C-CALR的细胞质检测及其与GR的关联性被Dex降低，而EPO增加，而这些操作对来自JAK2号机组+-光伏。（A）从NS（左）或JAK2号机组+-PV患者（右）。细胞在含有10%煤焦处理过的FBS的培养基中接受GFD 4小时，然后用Dex、EPO和SCF单独或联合刺激15分钟或4小时，如图所示。GAPDH被分析为负载控制。（B）从NS中获得的Erys的细胞质和细胞核部分的GRα（总的和在S211磷酸化的）、N-CALR和C-CALR的WB分析。在实验1中，细胞被GFD刺激4小时，然后用Dex单独或与RU486联合刺激15分钟。Lamin B1（LamB1）是核馏分的负荷控制。在实验2中，对细胞进行分析（增殖n个=Prol）或GFD后，然后用Dex、EPO、Dex+EPO、SCF或SCF+Dex治疗4小时，如图所示。蓝色和红色箭头分别表示GRα水平低于或高于GFD细胞中观察到的水平。HSP90和Lamin B1分别作为细胞质和细胞核部分的负荷控制进行分析。（C）Erys细胞质和核组分GRα和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-光伏。对细胞进行GFD，然后用SCF刺激15分钟或2小时。分析Lamin B1作为负荷控制。分析未经处理细胞的总裂解物（T）作为对照。（D）来自NS和JAK2号机组+-PV，如图所示。在GFD和Dex、EPO或SCF暴露15分钟和4小时后对细胞进行分析。分别用C-CALR和GR抗体获得红色和绿色信号。细胞核用DAPI染色。相同的细胞在（B）和（C）.原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E、F）Dex、EPO或SCF治疗4小时对NS患者GR和C-CALR共定位的影响（E）或JAK2号机组+-光伏。（F）如图所示，显示了与抗GR（绿色）和抗C-CALR（红色）抗体孵育的渗透性探针的单色和合并彩色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数2000×。（G）共聚焦显微镜在NS和GR探针中观察到的单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于不同的操作中。每项实验均一式三份，结果以方框图的形式显示，这些方框图是用24-39个NS细胞和5-10个NS细胞获得的结果JAK2号机组+-每个实验点的光伏电池。这些表格总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（在线提供彩色版本。）
图7
图7
在正常探针中，C-CALR的细胞质检测及其与GR的关联性被Dex降低，而EPO增加，而这些操作对来自JAK2号机组+-光伏。（A）从NS（左）或JAK2号机组+-PV患者（右）。细胞在含有10%煤焦处理过的FBS的培养基中接受GFD 4小时，然后用Dex、EPO和SCF单独或联合刺激15分钟或4小时，如图所示。GAPDH被分析为负载控制。（B）从NS中获得的Erys的细胞质和细胞核部分的GRα（总的和在S211磷酸化的）、N-CALR和C-CALR的WB分析。在实验1中，细胞被GFD刺激4小时，然后用Dex单独或与RU486联合刺激15分钟。Lamin B1（LamB1）是核馏分的负荷控制。在实验2中，对细胞进行分析（增殖n个=Prol）或GFD后，然后用Dex、EPO、Dex+EPO、SCF或SCF+Dex治疗4小时，如图所示。蓝色和红色箭头分别表示GRα水平低于或高于GFD细胞中观察到的水平。HSP90和Lamin B1分别作为细胞质和细胞核部分的负荷控制进行分析。（C）Erys细胞质和核组分GRα和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-光伏。对细胞进行GFD，然后用SCF刺激15分钟或2小时。分析Lamin B1作为负荷控制。分析未经处理细胞的总裂解物（T）作为对照。（D）来自NS和JAK2号机组+-PV，如图所示。在GFD和Dex、EPO或SCF暴露15分钟和4小时后对细胞进行分析。分别用C-CALR和GR抗体获得红色和绿色信号。细胞核用DAPI染色。相同的细胞在（B）和（C）.原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E、F）Dex、EPO或SCF治疗4小时对NS患者GR和C-CALR共定位的影响（E）或JAK2号机组+-光伏。（F）如图所示，显示了与抗GR（绿色）和抗C-CALR（红色）抗体孵育的渗透性探针的单色和合并彩色图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数2000×。（G）共聚焦显微镜在NS和GR探针中观察到的单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于不同的操作中。每项实验均一式三份，结果以方框图的形式显示，这些方框图是用24-39个NS细胞和5-10个NS细胞获得的结果JAK2号机组+-每个实验点的光伏电池。这些表格总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（在线提供彩色版本。）
图8
图8
Leptomycin降低正常来源的探针中C-CALR、GR和Dex的细胞质共定位反应性。（A）代表性NS探针中未经处理或用核出口抑制剂钩体霉素[35]处理30或60分钟的单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息。如图所示，ProErys按原样（Prol）或在用EPO处理4小时后进行分析。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）暴露于或不暴露于钩端霉素30分钟的NS第10天Erys的MTT掺入。NS探针来自于（A）如图所示，细胞在炭化处理的FBS中接受GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）和RU486培养24小时。结果以单独使用GFs获得的结果的百分比表示，并以单个数据点和三个单独实验中获得的结果平均值（±SEM）表示。第页显示各组之间的值（通过方差分析）。（在线提供彩色版本。）
图8
图8
Leptomycin降低正常来源的探针中C-CALR、GR和Dex的细胞质共定位反应性。（A）代表性NS探针中未经处理或用核出口抑制剂钩体霉素[35]处理30或60分钟的单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息。如图所示，ProErys按原样（Prol）或在用EPO处理4小时后进行分析。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）暴露于或不暴露于钩端霉素30分钟的NS第10天Erys的MTT掺入。NS探针来自于（A）如图所示，细胞在炭化处理的FBS中接受GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）和RU486培养24小时。结果以单独使用GFs获得的结果的百分比表示，并以单个数据点和三个单独实验中获得的结果平均值（±SEM）表示。第页显示各组之间的值（通过方差分析）。（在线提供彩色版本。）
图9
图9
抑制JAK信号增加细胞质中的C-CALR暴露，恢复C-CALR/GR共定位和Dex反应JAK2号机组+-光伏。（A）从第10天开始对总细胞裂解物的pSTAT5/STAT5、GRα和GRβ进行WB分析JAK2号机组+-PV和GFD，然后用GFs刺激加或不加ruxolitinib 24小时。GAPDH被分析为负载控制。（B）Erys总细胞裂解物的GRα、N-CALR和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-PV与或不与ruxolitinib培养24小时，然后GFD培养2小时。GAPDH作为内部控制加载。（C）根据GAPDH对Erys中的N-CALR和C-CALR含量进行量化，并将其作为对照进行分析JAK2号机组+-如图所示，PV在添加或不添加ruxolitinib的情况下培养2–24小时。报告了一个NS中Erys的C-CALR含量，以进行比较。C-CALR含量JAK2号机组+-PV Erys与ruxolitinb培养的Erys在统计学上存在差异（通过方差分析）。结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）（如适用）(n个= 3).（D）代表性渗透探针的共聚焦显微镜的合并图像扩展自JAK2号机组+-光伏。细胞在加入或不加入ruxolitinib的情况下培养2–24小时（与（A）和（B）). 用抗C-CALR（红色）或抗GR（绿色）抗体标记细胞。共定位区域为黄色。细胞核用DAPI染色。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E）共焦显微镜观察到的三个探针中单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于或不暴露于ruxolitinib，结果显示为12个NS细胞和18个NS细胞获得的结果的方框图JAK2号机组+-每个实验点的PV。该表总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（F）通过共焦显微镜检测来自JAK2号机组+-暴露于ruxolitinib的PV。共定位区域以黄色表示，并用箭头表示。在核周区检测到GR和C-CALR的单个和合并细胞质信号。原始放大倍数2000×。（G）在本研究使用的条件下，ruxolinitib治疗不会影响NS Erys的生存能力(n个=3-6）或JAK2号机组+-PV患者(n个= 4–8). 生存率通过甲苯胺蓝排除法进行评估。相同的细胞在（D）和（E）结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）。（H）从NS和JAK2号机组+-无论PV是否与ruxolitinib预孵育2-4小时，然后在炭化处理的FBS中培养GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）培养24小时。结果表示为未治疗组中单独使用GFs观察到的掺入水平的百分比，并表示为单个数据点和六个单独NS和JAK2号机组+-光伏实验。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图9
图9
抑制JAK信号增加细胞质中的C-CALR暴露，恢复C-CALR/GR共定位和Dex反应JAK2号机组+-光伏。（A）从第10天开始对总细胞裂解物的pSTAT5/STAT5、GRα和GRβ进行WB分析JAK2号机组+-PV和GFD，然后用GFs刺激加或不加ruxolitinib 24小时。GAPDH被分析为负载控制。（B）Erys总细胞裂解物的GRα、N-CALR和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-PV与或不与ruxolitinib培养24小时，然后GFD培养2小时。GAPDH作为内部控制加载。（C）根据GAPDH对Erys中的N-CALR和C-CALR含量进行量化，并将其作为对照进行分析JAK2号机组+-如图所示，PV在添加或不添加ruxolitinib的情况下培养2–24小时。报告了一个NS中Erys的C-CALR含量，以进行比较。C-CALR含量JAK2号机组+-PV Erys与ruxolitinb培养的Erys在统计学上存在差异（通过方差分析）。结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）（如适用）(n个= 3).（D）代表性渗透探针的共聚焦显微镜的合并图像扩展自JAK2号机组+-光伏。细胞在加入或不加入ruxolitinib的情况下培养2–24小时（与（A）和（B）). 用抗C-CALR（红色）或抗GR（绿色）抗体标记细胞。共定位区域为黄色。细胞核用DAPI染色。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E）共焦显微镜观察到的三个探针中单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于或不暴露于ruxolitinib，结果显示为12个NS细胞和18个NS细胞获得的结果的方框图JAK2号机组+-每个实验点的PV。该表总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（F）通过共焦显微镜检测来自JAK2号机组+-暴露于ruxolitinib的PV。共定位区域以黄色表示，并用箭头表示。在核周区检测到GR和C-CALR的单个和合并细胞质信号。原始放大倍数2000×。（G）在本研究使用的条件下，ruxolinitib治疗不会影响NS Erys的生存能力(n个=3-6）或JAK2号机组+-PV患者(n个= 4–8). 生存率通过甲苯胺蓝排除法进行评估。相同的细胞在（D）和（E）结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）。（H）从NS和JAK2号机组+-无论PV是否与ruxolitinib预孵育2-4小时，然后在炭化处理的FBS中培养GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）培养24小时。结果表示为未治疗组中单独使用GFs观察到的掺入水平的百分比，并表示为单个数据点和六个单独NS和JAK2号机组+-光伏实验。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图9
图9
抑制JAK信号增加细胞质中的C-CALR暴露，恢复C-CALR/GR共定位和Dex反应JAK2号机组+-光伏。（A）从第10天开始对总细胞裂解物的pSTAT5/STAT5、GRα和GRβ进行WB分析JAK2号机组+-PV和GFD，然后用GFs刺激加或不加ruxolitinib 24小时。GAPDH被分析为负载控制。（B）Erys总细胞裂解物的GRα、N-CALR和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-PV与或不与ruxolitinib培养24小时，然后GFD培养2小时。GAPDH作为内部控制加载。（C）根据GAPDH对Erys中的N-CALR和C-CALR含量进行量化，并将其作为对照进行分析JAK2号机组+-如图所示，PV在添加或不添加ruxolitinib的情况下培养2–24小时。报告了一个NS中Erys的C-CALR含量，以进行比较。C-CALR含量JAK2号机组+-PV Erys与ruxolitinb培养的Erys在统计学上存在差异（通过方差分析）。结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）（如适用）(n个= 3).（D）代表性渗透探针的共聚焦显微镜的合并图像扩展自JAK2号机组+-光伏。细胞在加入或不加入ruxolitinib的情况下培养2–24小时（与（A）和（B）). 用抗C-CALR（红色）或抗GR（绿色）抗体标记细胞。共定位区域为黄色。细胞核用DAPI染色。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E）共焦显微镜观察到的三个探针中单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于或不暴露于ruxolitinib，结果显示为12个NS细胞和18个NS细胞获得的结果的方框图JAK2号机组+-每个实验点的PV。该表总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（F）通过共焦显微镜检测来自JAK2号机组+-暴露于ruxolitinib的PV。共定位区域以黄色表示，并用箭头表示。在核周区检测到GR和C-CALR的单个和合并细胞质信号。原始放大倍数2000×。（G）在本研究使用的条件下，ruxolinitib治疗不会影响NS Erys的生存能力(n个=3-6）或JAK2号机组+-PV患者(n个= 4–8). 生存率通过甲苯胺蓝排除法进行评估。相同的细胞在（D）和（E）结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）。（H）从NS和JAK2号机组+-无论PV是否与ruxolitinib预孵育2-4小时，然后在炭化处理的FBS中培养GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）培养24小时。结果表示为未治疗组中单独使用GFs观察到的掺入水平的百分比，并表示为单个数据点和六个单独NS和JAK2号机组+-光伏实验。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图9
图9
抑制JAK信号增加细胞质中的C-CALR暴露，恢复C-CALR/GR共定位和Dex反应JAK2号机组+-光伏。（A）从第10天开始对总细胞裂解物的pSTAT5/STAT5、GRα和GRβ进行WB分析JAK2号机组+-PV和GFD，然后用GFs刺激加或不加ruxolitinib 24小时。GAPDH被分析为负载控制。（B）Erys总细胞裂解物的GRα、N-CALR和C-CALR的WB分析JAK2号机组+-PV与或不与ruxolitinib培养24小时，然后GFD培养2小时。GAPDH作为内部控制加载。（C）根据GAPDH对Erys中的N-CALR和C-CALR含量进行量化，并将其作为对照进行分析JAK2号机组+-如图所示，PV在添加或不添加ruxolitinib的情况下培养2–24小时。报告了一个NS中Erys的C-CALR含量，以进行比较。C-CALR含量JAK2号机组+-PV Erys与ruxolitinb培养的Erys在统计学上存在差异（通过方差分析）。结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）（如适用）(n个= 3).（D）代表性渗透探针的共聚焦显微镜的合并图像扩展自JAK2号机组+-光伏。细胞在加入或不加入ruxolitinib的情况下培养2–24小时（与（A）和（B）). 用抗C-CALR（红色）或抗GR（绿色）抗体标记细胞。共定位区域为黄色。细胞核用DAPI染色。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（E）共焦显微镜观察到的三个探针中单个和合并C-CALR和GR信号的量化JAK2号机组+-PV暴露于或不暴露于ruxolitinib，结果显示为12个NS细胞和18个NS细胞获得的结果的方框图JAK2号机组+-每个实验点的PV。该表总结了各组间通过Wilcoxon–Mann–Whitney检验具有统计显著性的差异。（F）通过共焦显微镜检测来自JAK2号机组+-暴露于ruxolitinib的PV。共定位区域以黄色表示，并用箭头表示。在核周区检测到GR和C-CALR的单个和合并细胞质信号。原始放大倍数2000×。（G）在本研究使用的条件下，ruxolinitib治疗不会影响NS Erys的生存能力(n个=3-6）或JAK2号机组+-PV患者(n个= 4–8). 生存率通过甲苯胺蓝排除法进行评估。相同的细胞在（D）和（E）结果显示为单个数据点和平均值（±SEM）。（H）从NS和JAK2号机组+-无论PV是否与ruxolitinib预孵育2-4小时，然后在炭化处理的FBS中培养GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）培养24小时。结果表示为未治疗组中单独使用GFs观察到的掺入水平的百分比，并表示为单个数据点和六个单独NS和JAK2号机组+-光伏实验。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图10
图10
钙的抑制2+通量增加了来自JAK2号机组+-PV但减少了探针的PVJAK2号机组+-用ruxolitinib治疗的PV和来自NS的未治疗Erys。（A）未经治疗或使用Io+BAPTA或TG+BAPTA治疗的NS探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息JAK2号机组+-PV用鲁索利替尼处理或不处理2小时，然后暴露于Io+BAPTA或TG+BAPTA，如图3G所示。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（C）未经治疗的NS和未经治疗或ruxolitinib治疗的第10天Erys的MTT掺入JAK2号机组+-暴露或未暴露于Io+BAPTA或TG+BAPTA的PV（相同的细胞出现在（A）和（B）). 细胞在煤焦处理的FBS中GFD培养2小时，然后与GFs（SCF、IL-3和EPO）一起培养24小时，无论是否含有Dex，也无论是否含有RU486。结果表示为未接触钙的实验组中仅用GFs观察到的掺入水平的百分比2+通量抑制剂和作为单独的数据点以及在三个单独的NS和JAK2号机组+-光伏实验。未接触Ca的对照2+通量抑制剂进行了重复分析。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图10
图10
钙的抑制2+通量增加了来自JAK2号机组+-PV但减少了探针的PVJAK2号机组+-用ruxolitinib治疗的PV和来自NS的未治疗Erys。（A）未经治疗或使用Io+BAPTA或TG+BAPTA治疗的NS探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息JAK2号机组+-PV用鲁索利替尼处理或不处理2小时，然后暴露于Io+BAPTA或TG+BAPTA，如图3G所示。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（C）未经治疗的NS和未经治疗或ruxolitinib治疗的第10天Erys的MTT掺入JAK2号机组+-暴露或未暴露于Io+BAPTA或TG+BAPTA的PV（相同的细胞出现在（A）和（B）). 细胞在煤焦处理的FBS中GFD培养2小时，然后与GFs（SCF、IL-3和EPO）一起培养24小时，无论是否含有Dex，也无论是否含有RU486。结果表示为未接触钙的实验组中仅用GFs观察到的掺入水平的百分比2+通量抑制剂和作为单独的数据点以及在三个单独的NS和JAK2号机组+-光伏实验。未接触Ca的对照2+通量抑制剂进行了重复分析。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图10
图10
钙的抑制2+通量增加了来自JAK2号机组+-PV但减少了探针的PVJAK2号机组+-用ruxolitinib治疗的PV和来自NS的未治疗Erys。（A）未经治疗或使用Io+BAPTA或TG+BAPTA治疗的NS探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息JAK2号机组+-PV用鲁索利替尼处理或不处理2小时，然后暴露于Io+BAPTA或TG+BAPTA，如图3G所示。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（C）未经治疗的NS和未经治疗或ruxolitinib治疗的第10天Erys的MTT掺入JAK2号机组+-暴露或未暴露于Io+BAPTA或TG+BAPTA的PV（相同的细胞出现在（A）和（B）). 细胞在煤焦处理的FBS中GFD培养2小时，然后与GFs（SCF、IL-3和EPO）一起培养24小时，无论是否含有Dex，也无论是否含有RU486。结果表示为未接触钙的实验组中仅用GFs观察到的掺入水平的百分比2+通量抑制剂和作为单独的数据点以及在三个单独的NS和JAK2号机组+-光伏实验。未接触Ca的对照2+通量抑制剂进行了重复分析。第页通过方差分析计算值。（在线提供彩色版本。）
图11
图11
抑制核输出降低了C-CALR/GRα的细胞质共定位和来自JAK2号机组+-用ruxolitinib治疗PV。（A）未经处理探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息JAK2号机组+-PV和inJAK2号机组+-如图所示，PV探针用红霉素治疗2小时或用红霉素处理2小时，然后暴露于钩端霉素30分钟。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）未经治疗（左）或经ruxolitinib治疗（右）的第10天Erys的MTT掺入JAK2号机组+-PV暴露于或不暴露于钩端霉素30分钟。JAK2号机组+-PV来自于（A）如图所示，细胞在炭化处理的FBS中接受GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）和RU486培养24小时。结果表示为未治疗组中单独使用GFs观察到的掺入水平的百分比，并表示为单个数据点和三个单独的数据点的平均值（±SEM）JAK2号机组+-光伏实验。第页通过方差分析计算值。nd=未完成。（在线提供彩色版本。）
图11
图11
抑制核输出降低了C-CALR/GRα的细胞质共定位和来自JAK2号机组+-用ruxolitinib治疗PV。（A）未经处理探针中单个和合并共焦C-CALR（红色）和GR（绿色）信号的详细信息JAK2号机组+-PV和inJAK2号机组+-如图所示，PV探针用红霉素治疗2小时或用红霉素处理2小时，然后暴露于钩端霉素30分钟。细胞核用DAPI染色（蓝色）。原始放大倍数1500×。代表性比例尺对应于10μm。（B）未经治疗（左）或经ruxolitinib治疗（右）的第10天Erys的MTT掺入JAK2号机组+-PV暴露于或不暴露于钩端霉素30分钟。JAK2号机组+-PV来自于（A）如图所示，细胞在炭化处理的FBS中接受GFD 2小时，并与GFs（SCF、IL-3和EPO）（含或不含Dex）和RU486培养24小时。结果表示为未治疗组中单独使用GFs观察到的掺入水平的百分比，并表示为单个数据点和三个单独的数据点的平均值（±SEM）JAK2号机组+-光伏实验。第页通过方差分析计算值。nd=未完成。（在线提供彩色版本。）
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Michalak M、Corbett EF、Mesaeli N、Nakamura K、Opas M.钙网蛋白：一种蛋白质、一种基因、多种功能。《生物化学杂志》1999；344:281–292。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 姜瑜，戴斯，松下H.钙网蛋白：在细胞表面蛋白表达中的作用。膜（巴塞尔）2014；4:630–641.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Michalak M，Groenendyk J，Szabo E，Gold LI，Opas M.钙网蛋白，内质网的多过程钙缓冲伴侣。生物化学杂志2009；417:651–666。-公共医学
    1. Chouquet A、Paidassi H、Ling WL等。人钙网蛋白球状结构域的X射线结构揭示了肽结合区，并提示了多分子机制。《公共科学图书馆·综合》。2011;6:e17886。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ghiran I，Klickstein LB，Nicholson-Weller A.钙网蛋白位于循环中性粒细胞的表面，并使用CD59作为适配器分子。生物化学杂志。2003;278:21024–21031.-公共医学

出版物类型

MeSH术语