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.2017年5月;65(5):773-789.
doi:10.1002/glia.23125。 Epub 2017年2月16日。

下丘脑单核细胞糖敏感的甜味受体依赖机制

附属公司

一种甜味受体依赖性的下丘脑tanycytes葡萄糖增敏机制

希瑟·本福德等。 格利亚. 2017年5月.

摘要

下丘脑单核细胞是一种胶质样的葡萄糖敏感细胞,与第三脑室的脑脊液接触,并向下丘脑细胞核发送过程,控制食物摄入和体重。单核细胞葡萄糖敏感的机制尚不明确。虽然单核细胞表达与胰腺β细胞葡萄糖敏感相关的成分,但它们通过ATP受体依赖机制对不可代谢的葡萄糖类似物作出反应。这里,我们表明啮齿动物的单核细胞对甜味(Tas1r2/Tas1r3)受体配体已知的非营养性甜味剂作出反应。最初的甜味刺激反应需要细胞外钙的存在2+导致ATP释放和更大的钙增殖2+P2Y1受体介导的反应。在Tas1r2缺失小鼠中,这些小鼠中葡萄糖无反应的tanycytes的比例大大增加,但一部分tanycytes对葡萄糖的敏感性没有降低。我们的数据表明,甜味受体在大约60%的葡萄糖敏感单核细胞中介导葡萄糖敏感,而其余40%的葡萄糖敏感双核细胞使用其他一些未知的机制。

关键词:能量平衡;下丘脑;单核细胞。

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数字

图1
图1
生成任务1r2使鼠标无效。显示结构的示意图任务1r2基因和产生敲除小鼠的策略。从上到下,目标构造任务1r2野生型等位基因,靶向任务1r2前等位基因(neo+)和之后(neo)显示了新霉素选择盒(ACN)的自诱导缺失。浅灰色框表示任务1r2基因或插入的小鼠视蛋白1毫微秒基因。插入序列由视蛋白mws编码序列和ACN盒组成。这盘录音带,两侧是LoxP公司包含睾丸特异性血管紧张素转换酶启动子以驱动Cre重组酶的表达,以及小鼠RNA聚合酶II启动子以推动新霉素耐药基因的表达
图2
图2
幼年大鼠下丘脑切片中的单核细胞对非营养性甜味剂产生反应。(a) 伪彩色图像蒙太奇,显示单核细胞对20µm比例尺的RebA烟雾的反应。吸管的尖端如第一张图片所示。蒙太奇的第一张图像(白色)中显示了绘制在单个tanycytes周围以测量其激活的ROI。数字对应于(b)中的计时。白色箭头表示单个单核细胞胞体的反应,其中Ca2+在响应过程中,高度是可以明显区分的。(b) 量化ROI中对RebA、三氯蔗糖和AceK的响应,这些ROI围绕每个图的同一切片中的单个单核细胞绘制。每种甜味剂在不同的薄片上测试。仅Ca2+ROI中显示的响应单字节记录
图3
图3
成年小鼠下丘脑切片中的单核细胞对非营养性甜味剂产生反应。(a) 伪彩色图像蒙太奇,显示了tanycytes对RebA的反应,比例尺为20µm。吸管的尖端如第一张图片所示。围绕单个单核细胞绘制的ROI用于测量其激活情况,如蒙太奇的第一幅图像所示(白色)。数字对应于(b)中的计时。(b) 量化ROI中对RebA、三氯蔗糖和AceK的响应,这些ROI围绕每个图的同一切片中的单个单核细胞绘制。仅Ca2+显示了响应单字节ROI的跟踪。每种甜味剂在不同的薄片上测试
图4
图4
针对基因编码Ca的AdV‐pTSHR‐GCaMP3构建2+报告者到tanycytes[彩色数字可在以下网址查看wileyonlinelibrary.com]
图5
图5
AdV‐pTSHR‐GCaMP3专门转换tanycytes。表达GCaMP3的细胞在细胞体和胞体中表达波形蛋白,波形蛋白是单核细胞的标记,并且具有单核细胞典型的形态[胞体排列在第三脑室(3V)中,并且有一个向内的过程]。插图显示了波形蛋白与GCaMP3在细胞体中的共定位,并从不同部分以较高放大倍数进行处理。插入的比例尺100和25µm
图6
图6
AdV‐pTSHR‐GCaMP3不转导星形胶质细胞或神经元。表达GCaMP3的细胞是表达病毒衣壳己糖蛋白的细胞的一个子集,这表明仅在一个子集转导细胞中选择性启动子驱动的GCaMP1表达。表达GFAP的星形胶质细胞即使靠近心室壁也不表达GCaMP3。tanycytes的一个子集也表达GFAP。脑实质中的NeuN+神经元不表达GCaMP3。比例尺100µm
图7
图7
表达GCaMP3的小鼠中经基因鉴定的单核细胞对非营养性甜味剂有反应。(a) 蒙太奇显示单核细胞对一口AceK的反应。细胞体和单核细胞过程中的荧光增强。数字对应于(b)中的时间刻度。比例尺20µm。3V表示第三个心室。蒙太奇的第一张图像中显示的ROI。(b,c)量化围绕单个单核细胞绘制的ROI中对AceK和RebA的响应。(b)中的分析来自与(a)相同的实验。(b,c)来自不同的切片wileyonlinelibrary.com]
图8
图8
对非营养性甜味剂的次要反应取决于P2Y1受体的激活。(a) 100 nM MRS2500大大降低了单核细胞对RebA的反应。左面板,对照MRS2500中单个单核细胞的ROI测量,并在同一切片中清洗。右侧面板,直方图显示7个切片的分组数据,量化了对RebA的主要响应和总响应。主要响应不受影响,但总响应减少到与仅主要响应相同的大小。插图显示了对非营养性甜味剂的主要和次要反应示例。插图,左侧:将对RebA的反应阶段(在黑条中应用)细分为初级反应(甜味受体介导,蓝色)和次级反应(ATP受体介导的,红色)。插图,右:同一切片中的两个tanycytes分别对RebA(在黑条期间应用)表现出初级和次级反应的例子。箭头指示次级反应的开始。请注意,在这两种情况下,初级反应的开始时间都比次级反应慢,而次级反应的持续时间可能要长得多(黑条)。(b) 左侧面板,MRS2500(100 nM)几乎完全阻断了对三氯蔗糖的反应(从一个切片中的单个单核细胞进行ROI测量)。右侧面板,显示MRS2500对七个切片三氯蔗糖反应的影响的汇总直方图。(c) 左侧面板,MRS2500(100 nM)对小鼠AceK的单核细胞反应无影响(单个切片中单个单核细胞的ROI测量)。右面板,摘要直方图,显示来自6个切片的鼠标数据和3个切片的大鼠数据。用Friedman二元方差分析进行的所有统计比较
图9
图9
对非营养性甜味剂的反应需要细胞外钙2+(a,左面板)通过清除细胞外钙,大鼠对AceK的反应几乎完全消失2+(单个切片中单个tanycytes的ROI测量值)。(a,右面板)显示9个切片数据的摘要直方图。(b,左面板)当细胞外Ca2+删除(单个切片中单个tanycytes的ROI测量)。(b,右面板)显示7个切片数据的摘要直方图。仅主要回应(n个 = 4片)显示出相同的趋势,但这种影响并不显著。(c,左侧面板)排空内部存储(CPA)和清除细胞外Ca的组合2+与单独去除细胞外CPA相比,RebA的总反应降低幅度更大(单个切片中单个单核细胞的ROI测量值)。(c,右面板)八个切片的摘要直方图。用Friedman二元方差分析进行的所有统计比较
图10
图10
RT-PCR数据任务1r2任务1 r3在单核细胞层和下丘脑中表达。底漆任务1r2任务1 r3提供了预期大小的PCR产物。扩增子的身份已通过测序得到证实
图11
图11
的特征任务1r2使鼠标无效。(a,b)基因组Southern Blot分析任务1r2 +/+任务1r2 +/天老鼠。经济效益用5′侧翼探针I(a)对从野生型或杂合动物中提取的I消化基因组DNA进行Southern Blot分析,该探针可区分野生型和连锁等位基因任务1r2或内部探针II(b)验证Cre重组酶对ACN盒的自切除。图1中显示了探头I和II。(c) 基因型分析任务1r2老鼠。PCR产物鉴定基因型任务1r2基于特定寡核苷酸的小鼠系。(d) 在逆转录酶存在或不存在的情况下,对从舌乳头(此处为vallate乳头,CV)分离的RNA进行cDNA合成。PCR产品特定于任务1r2仅在野生型动物中检测到,而视蛋白mws仅在任务1r2味觉组织中的小鼠无效。(e) 组织切片的原位杂交分析任务1r2动物。C57BL/6野生型和纯合型瓣膜乳头的组织切片任务1r2将空白小鼠与地高辛标记的核糖探针杂交,识别任务1r2视蛋白分子量当C57BL/6小鼠的组织切片与任务1r2反义核糖探针(as)。然而,在与视蛋白分子量作为探针。与之相比,在纯合子的组织切片中任务1r2null小鼠杂交时未检测到标记任务1r2作为核糖探针,而与视蛋白mws作为核糖探头杂交,可标记出相当数量的细胞,表明mws的成功敲入和敲除任务1r2与相应的正义核糖探针杂交的组织切片没有显示任何标记
图12
图12
甜味受体介导下丘脑单核细胞的葡萄糖敏感。(a) 葡萄糖敏感单核细胞的比例在任务1r2与野生型小鼠相比,空白小鼠。(b) 单核细胞中葡萄糖反应的幅度任务1r2空白小鼠与野生型小鼠相同。(c) 当计算所有单核细胞的葡萄糖敏感性时(即包括那些没有反应的细胞和那些有反应的细胞),总体反应幅度会大大降低***第页 < .0001χ 2测试;在(b和c)中,每个点代表单个小鼠对葡萄糖的平均单核细胞反应幅度。方框图和胡须图显示了中位数、上四分位数和下四分位数以及范围

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引用人

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