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.2017年4月13日；91（9）：e02104-16。
doi:10.1128/JVI.02104-16。 2017年5月1日印刷。

流感病毒蛋白质在质膜芽层区域的横向组织

乔治·P·莱斯 1, 罗伯特·A·兰姆 2
附属公司

流感病毒蛋白质在质膜芽层区域的横向组织

乔治·P·莱斯等。 J维罗尔. .

摘要

流感病毒在病毒感染细胞的质膜上聚集和萌发。病毒蛋白在质膜上的同一位置聚集，以便出芽。这涉及病毒蛋白之间复杂的相互作用网络。一些蛋白质，如血凝素（HA）、NA和M2，是完整的膜蛋白。M1与外周膜相关，而NP与病毒RNA相关，形成RNP复合物，与质膜的细胞质表面相关。此外，HA和NP已被证明集中在富含胆固醇的膜筏结构域，而M2虽然包含胆固醇结合基序，但与筏无关。在这里，我们使用免疫金染色来鉴定质膜平面片中的病毒蛋白。使用Ripley K函数（一种最近邻分析）对这些蛋白质的分布进行单独和成对检查。分别显示HA、NA、M1、M2和NP在质膜内或质膜上自结合。HA和M2在质膜中强烈聚集；然而，在NA和M2的情况下，聚类取决于所使用的表达系统。尽管这两种蛋白都是筏驻留蛋白，但HA和NA占据不同但相邻的膜域。M2和M1强共簇，但M1与HA或NA的关联取决于表达方式。HA和NP在出芽部位的存在取决于其他病毒蛋白的共表达。同样，M2和NP占据不同的隔室，但M1的共同表达可以桥接两者之间的联系。重要性子代病毒出芽所需的流感病毒蛋白补体需要在布多松积累。由于HA和NA位于脂筏样结构域，这一情况变得复杂，而M2虽然是一种完整的膜蛋白，但与脂筏无关。其他必需的蛋白质组分，如M1和NP，在外周与膜结合。我们的数据定义了质膜中病毒蛋白之间的空间关系。一些蛋白质，如透明质酸和M2，在膜内固有地共生，尽管M2主要位于透明质酸区域的外围，这与M2在芽端分裂中的作用一致。一些流感病毒蛋白对之间的关联，如M2和NP，似乎由额外的流感病毒蛋白介导，在本例中为M1。HA和NA虽然与筏相关，但位于不同的区域，反映了它们在病毒膜中的分布。

关键词：臭氧；免疫金标记；流感病毒组装；穗的横向组织；蛋白质组织；病毒出芽。

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数字

图1
图1
在薄膜上观察到新生流感病毒。从感染流感病毒A/WSN/33的CV1细胞制备了一种平面的质膜片。WSN以球形粒子的形式萌芽，可通过电子密度vRNP核识别（红色圆圈）。带有芽殖病毒的假定布多松被视为电子密度高的区域（示例位于蓝色方框中）。膜的细胞质面朝上；通常，尽管病毒是通过膜片（插图中的黄色箭头）观察到的，但病毒糖蛋白表面的尖峰是可以识别的。条形，200 nm。
图2
图2
用于分析的膜片示例，对M2和HA进行染色。（A） 感染流感病毒A/Udorn/72的MDCK细胞在12小时p.i.时的一片质膜，已染色显示M2（6纳米金颗粒）和HA（12纳米金粒子）。在所有图中，由6纳米金颗粒识别的蛋白质列在第一位，而那些用12纳米金颗粒染色的蛋白质列第二位。为了更容易地显示金染色，插图以更高的放大率显示了图像的方框区域。可见具有特征晶格结构的氯氰菊酯涂层凹坑（红色箭头）。（B） 所有金色标签的位置用于创建一个列表x个,年用于后续分析的坐标。图中显示了面板A中的金色标签，两个面板中都有相同的区域。棒材，200 nm。
图3
图3
流感病毒蛋白HA、NA、M2、M1和NP在由Udorn病毒感染细胞和转染DNA表达病毒蛋白的细胞制备的膜中的个别分布。单个流感病毒蛋白HA、NA、M2、M1和NP的分布显示为感染（左）（蓝色）或转染（中间）（红色）细胞。右栏显示了感染（inf）和转染（trans）样本的单个蛋白质分布的Ripley分析的平均线性变换。在本图和随后的图中，“转染的”表示用表达所述病毒蛋白的质粒DNA转染的细胞(n个每种实验条件下=2）。Lr-r，L（左）(第页) −第页，其中L（左）代表Ripley的K函数的线性变换第页是距离，在这种情况下是半径。
图4
图4
流感病毒细胞表面表达蛋白的相对分布。在12 h p.i.时从WSN感染的MDCK细胞或在转染后24 h从293T细胞制备质膜平面片。用材料和方法中描述的免疫试剂标记膜，并用电子显微镜检查。（A） 分析围绕每个M2蛋白（6-nm金粒子）的HA（12-nm金粒子的密度，最大半径为200nm，表示为双变量Ripley分析数据的平均线性变换。在病毒感染的MDCK和转染的293T细胞中检测野生型M2和mut1M2相对于HA的分布(n个=感染细胞中M2-HA的5，n个=感染细胞中mut1M2-HA的4，n个=转染细胞中M2-HA为4，以及n个对于转染细胞中的mut1M2-HA＝3）。（B） 通过Ripley分析比较病毒感染和转染细胞中M2或mut1M2（6纳米金颗粒）和NA（12纳米金颗粒(n个=感染细胞中M2-NA为4，n个=感染细胞中mut1M2-NA的4，n个=转染细胞中M2-NA的2，以及n个=转染细胞中mut1M2-NA的2）。（C） 比较病毒感染细胞和转染细胞中HA（12-nm金颗粒）和NA（6-nm金粒子）的空间排列。插图显示了金粒子分布的图形表示，代表性图像显示了HA和NA占据的独立但并列的区域，如双变量Ripley分析所述(n个=感染细胞中NA-HA为3，以及n个=转染细胞中NA-HA为4）。
图5
图5
与流感病毒表面蛋白相比，M1的相对膜分布。（A） 通过对病毒感染和转染细胞制备的平面膜染色片进行双变量Ripley分析，确定M1（6-nm金颗粒）相对于HA或NA（12-nm金粒子）的共分布(n个=感染细胞中M1-HA的4，n个=转染细胞中M1-HA为4，n个=感染细胞中M1-NA为3，以及n个=3，对于转染细胞中的M1-NA）。（B） 双变量Ripley分析比较了膜相关M1（12-nm金颗粒）与M2或mut1M2（6-nm金粒子）的分布(n个=感染细胞中M2-M1的4，n个=转染细胞中M2-M1的2，n个感染细胞中的mut1M2-M1为4，以及n个=转染细胞中mut1M2-M1的2）。
图6
图6
膜相关NP相对于HA、NA、M2或M1的空间关系。（A） 感染和转染细胞中NP（6纳米金颗粒）和HA（12纳米金粒子）的分布比较。NP和HA染色的双变量Ripley分析结果也显示了293T细胞，这些细胞转染后表达M1、M2、NA、NP和HA(n个=感染细胞中的NP-HA为3，n个=转染细胞中NP-HA为3，以及n个=3，对于转染细胞中的M1-M2-NA-NP-HA）。（B和C）通过双变量Ripley分析描述的感染或转染细胞制备的膜中NP（6-nm金粒子）和NA（12-nm金粒子(n个=感染细胞中的NP-NA为3，n个=转染细胞中的NP-NA为3，n个=感染细胞中NP-M1的4，以及n个=转染细胞中NP-M1为5）。（D） 比较NP（12-nm金颗粒）和M2（6-nm金粒子）在感染细胞和转染细胞中的分布。还检测了NP与M2或与M1共转染的mut1M2之间的共定位程度(n个=感染细胞中M2-NP的4，n个=转染细胞中M2-NP的5，n个=2，对于转染细胞中的M1-M2-NP，以及n个=2，对于转染细胞中的M1-mut1M2-NP）。
图7
图7
HA和NA的细胞质尾部在蛋白质共定位中的作用。MDCK细胞被重组流感病毒感染，该病毒编码HA和NA，但缺乏其胞质尾部。（A） 比较了细胞质无尾糖蛋白（12-nm金颗粒）和M2（6-nm金粒子）的分布。还检测了表达M2的转染293T细胞和HA或NA的细胞质尾部缺失突变体(n个=感染细胞中M2-HAtail−的2，n个=转染细胞中M2-HAtail−的2，n个=感染细胞中M2-NAtail−的2，以及n个=转染细胞中的M2-NAtail−为2）。（B） 通过双变量Ripley分析，比较了病毒感染的MDCK细胞和转染的293T细胞中M1（6-nm金颗粒）和HA和NA（12-nm金颗粒(n个=感染细胞中M1-HAtail−的2，n个=3，对于转染细胞中的M1-HAtail−，n个=感染细胞中M1-NAtail−为4，以及n个=2，对于转染细胞中的M1-NAtail−）。
图8
图8
流感病毒蛋白在感染细胞膜中的分布模型。图示为HA、NA、M1、M2和NP蛋白在流感病毒感染细胞膜中的分布。而一些蛋白质对，如HA-M2、NA-NA、M2-M1和NP-M1，共簇，其他蛋白质对，例如HA-M1、NA-M2、NP-HA和M2-NP，可能通过间接的蛋白质或脂质相互作用在出芽部位聚集在一起。例如，M2和NP的共定位可能通过与M1共聚集的两种蛋白质来促进。虽然HA、NA和M2是完整的膜蛋白，但M1和NP都用开放符号表示，表示它们与质膜的细胞质表面相关。
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