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.2017年2月9日;2(3):e89676。
doi:10.1172/jci.insight.89676。

条件HO-1中线粒体质量控制失调-/-老鼠

附属公司

条件HO-1中线粒体质量控制失调-/-老鼠

哈吉尔·B·苏利曼等。 JCI洞察力. .

摘要

血红素氧化酶-1(Hmox1型检测HO-1)通路对心肌细胞特异性线粒体质量控制的防御作用Hmox1型KO小鼠(HO-1[CM]-/-)暴露于氧化应激(100%O2). 暴露48小时后,这些小鼠表现出持续的心脏炎症和氧化组织损伤,从而导致肌体破裂、心肌细胞死亡、左心室功能障碍和心肌病,而对照组的心脏表现出最小的损伤。高氧后,HO-1(CM)-/-心脏表现出Pgc-1α/核呼吸因子-1(NRF-1)轴抑制、肿胀、电镜下低电子密度线粒体、细胞死亡增加和大量胶原沉积。损伤机制包括结构缺陷的自噬/有丝分裂、受损的LC3II处理和未能上调粉红色1-和公园2-介导的有丝分裂。NRF-1与两个基因上的近端启动子位点结合的缺失抑制了有丝分裂途径。这些结果表明心脏Hmox1型诱导不仅可以防止血红素毒性,还可以调节线粒体质量控制基因程序的时间和注册,从而限制细胞死亡、病理重塑和心脏纤维化。

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数字

图1
图1。HO-1的心肌细胞特异性消融和短暂高氧反应。
(A类)WT/Cre、HO-1/Cre和HO-1(CM)中心脏HO-1的qPCR分析–/–小鼠服用三苯氧胺8d后。结果表示为平均值±SEM;水平条代表平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个=6/组)。(B类)Western blot显示HO-1蛋白分析。(C类)WT/Cre和HO-1(CM)中HO-1 mRNA的表达–/–在100%氧之前和之后服用三苯氧胺2(高氧)。结果为平均值±SEM;水平条表示平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个= 6). (D类)典型的Western blot显示WT/Cre和HO-1(CM)中的HO-1和HO-2蛋白水平–/–高氧前后的心脏。(E类)WT/Cre和HO-1(CM)的心脏中矢状切面图像–/–小鼠在高氧前后服用三苯氧胺后,HO-1(CM)心室壁变薄–/–O之后的红心2右面板为对照WT/Cre小鼠在空气中三苯氧胺暴露48小时和空气中暴露8天后,H&E染色的LV切片的显微照片;控制HO-1(CM)–/–小鼠在空气中三苯氧胺,高氧48h,空气中8d。删除HO-1,然后删除O2导致急性炎症病灶(长箭头)。与WT/Cre中的心肌细胞相比,存在肌原纤维丢失、心肌细胞肿胀、苍白和细胞死亡(短箭头)。单用三苯氧胺不会干扰细胞构筑,但HO-1缺失后,高氧会导致持续性心脏损伤(原始放大倍数×250;刻度条=10μm)。(F类)WT/Cre和HO-1(CM)心肌ANF和BNP的Western分析–/–老鼠。考马斯染色用作负荷对照。密度测定法(G公司)ANF和(H(H))BNP(平均值±SEM*P(P)高氧前后<0.05;n个=6/组;双向方差分析)。
图2
图2。小鼠心脏HO-1消融后高氧氧化应激、炎症和细胞死亡。
(A类)心脏丙二醛水平(B类)心脏羰基化蛋白水平,以及(C类)4组小鼠的8-OHdG水平(平均值±SEM*P(P)高钾血症前与高钾血症后<0.05;n个=6/组)。(D类F类)用qPCR分析IL-1β、IL-18和iNOS(NOS2)的炎症标志物(平均值±扫描电镜)*P(P)高氧前后<0.05;n个=6/组)。(G公司)4组小鼠心脏切片中的TUNEL阳性细胞。图像是TUNEL阳性细胞核(红色)与DAPI染色细胞核(蓝色)的叠加。品红花期表明TUNEL阳性细胞。HO-1(CM)中三苯氧胺后出现过度TUNEL染色–/–高氧后小鼠与其他组比较(比例尺=20μm)。(H(H))心脏切片中TUNEL阳性细胞核的定量(平均值±SEM;水平条表示平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个=6/组;双向方差分析)。
图3
图3。高氧后小鼠心脏线粒体密度和结构。
(A类)心脏柠檬酸合酶(CS,绿色)免疫荧光染色的显微照片。对照组WT/Cre心脏心肌细胞线粒体CS标记正常;高氧后8d WT/Cre心脏CS标记和线粒体荧光强度增加;HO-1(CM)–/–保持在空气中的小鼠心脏仅显示线粒体密度略有下降;HO-1(CM)–/–高氧后第8天,小鼠心脏的CS标记降低,线粒体荧光强度下降,表明高氧导致HO-1缺乏时线粒体持续损伤和细胞变性。原始放大倍数,200×;比例尺=100μm。(B类)通过Western blotting,高氧后8d,WT/Cre小鼠线粒体CS和Tfam表达显著增加,但HO-1(CM)小鼠线粒体CS与Tfam的表达没有显著增加–/–小鼠(平均值±SEM;横条代表平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个=每组6人)。(C类)心肌超微结构的电镜观察。对照WT/Cre小鼠心肌细胞的电子显微照片,显示线性肌原纤维排列和正常线粒体;暴露于高氧环境下的WT/Cre小鼠自噬增强,箭头指示有丝分裂体;HO-1的电子显微照片(CM)–/–小鼠膜内间隙扩张(长箭头);HO-1(CM)–/–高氧后会造成严重损伤,包括肌丝定向障碍和线粒体(M)聚集。图像显示线粒体肿胀、紊乱,嵴结构异常(短箭头),线粒体碎片(长箭头),表明呼吸能力较差(n个=6/组)。注意线粒体缺乏。原始放大倍数12000×;比例尺=1μm。(D类)qPCR检测心脏中Drp1 mRNA的表达。(E类)qPCR检测心脏中Opa1 mRNA的表达。将数值标准化为18S水平(平均值±SEM;水平条表示平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个=6/组;双向方差分析)。
图4
图4。HO-1与心脏线粒体生物发生的调节。
(A类)HO-1的缺失降低了线粒体编码基因ND1在心脏的mRNA表达。(B类)HO-1的缺失降低了核编码基因ND5在心脏的mRNA表达。(C类)qPCR显示HO-1缺陷心脏高氧后线粒体mtDNA拷贝数显著下降。(D类)调节线粒体基因组的核编码NRF-1和PGC-1α蛋白的代表性蛋白质印迹。(E类F类)通过密度测定法,NRF-1和PGC-1α的定量与负荷对照组Lamin B相关。HO-1消融导致NRF-1转录因子和PGC-α辅活化蛋白在心脏中的表达降低(平均值±SEM;水平条代表平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个=6/组;双向方差分析)。
图5
图5。HO-1的缺失会损害小鼠心脏的自噬/有丝分裂。
(A类D类)WT/Cre和HO-1(CM)的心脏总蛋白–/–对小鼠高氧前后LC3II/I、p62、Atg4B和Beclin1蛋白表达进行定量。考马斯染色作为负荷对照。HO-1(CM)中LC3-II/LC3-I的比率显著降低–/–小鼠高氧后第8天。相反,在WT/Cre小鼠中,LC3-I表达增加,高氧后心脏中LC3-II的转化显著增强(平均值±SEM;水平条代表平均值)*P(P)高氧前后<0.05;†P(P)与HO-1(CM)相比,WT/Cre<0.05–/–;n个=每组6人;双向方差分析)。
图6
图6。HO-1是高氧后通过NRF-1激活Pink1和Park2基因表达所必需的。
(A类)WT/Cre和HO-1(CM)心脏线粒体部分Parkin(Park2)和PINK1的代表性蛋白质印迹–/–高氧前和高氧后制备的小鼠。孔蛋白被用作负荷控制。(B类)HO-1(CM)中HO-1的删除–/–小鼠心脏Park2 mRNA表达降低(C类)HO-1核心缺乏HO-1(CM)–/–小鼠PINK1 mRNA表达降低(D类)Pink1(ENSMUST00000030536)和Park2(ENSMOST00000191124)启动子区域的示意图(-500至+200 bp)。使用rVISTA 2.0在人和小鼠之间对齐序列。通过Genomatix和DNAsis软件搜索转录起始位点(TSS)上游的NRF-1结合位点,在人和小鼠Pink1和Park2基因启动子中确定了NRF-1的多个共有基序。(E类)通过ChIP分析研究体内NRF-1启动子的占有率。输入通道显示了免疫沉淀前来自染色质的PCR产物。NRF-1抗体用于免疫沉淀,而IgG用作阴性对照。通过PCR分析沉淀的DNA,并使用针对3个启动子的引物集(平均值±SEM;水平条代表平均值*P(P)高氧前后<0.05;n个=每组6人;双向方差分析)。
图7
图7。HO-1缺失增强了高氧后的心脏纤维化。
(A类)心脏切片用Masson三色染色以定位胶原蛋白(蓝色,纤维状胶原蛋白),显示HO-1(CM)左心室广泛纤维化–/–小鼠,主要在高氧后(比例尺=50μm)。(B类)该图显示了密度测定法对纤维化的定量。(C类)两种小鼠高氧前后Col1A1 mRNA水平分析。(D类). 高氧前后制备的心脏裂解物中TGF-β和CCN5蛋白表达的Western blots。图中显示了TGF-β和CCN5蛋白质的定量,其密度测定与考马斯加载控制有关(平均值±SEM;水平条代表平均值*P(P)高氧前后<0.05;†P(P)WT/Cre vs.HO-1(CM)<0.05–/–;n个=每组6人;双向方差分析)。

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