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.2017年2月17日；45(3):1091-1104.
doi:10.1093/nar/gkw966。

HOTAIRM1对染色质状态和结构的相互调节有助于时间共线HOXA基因的激活

薛Q D Wang 1, 何塞·多斯蒂 1
附属机构

HOTAIRM1对染色质状态和结构的相互调节有助于时间共线HOXA基因的激活

薛Q D Wang等。 核酸研究. .

摘要

哺乳动物中已鉴定出数千种长非编码RNA（lncRNAs），其中许多是基因表达的重要调节因子。然而，lncRNAs用于控制转录的机制在很大程度上仍未明确。在这里，我们报道了HOTAIRM1，一种在白血病和实体瘤中有前途的lncRNA生物标志物。我们发现HOTAIRM1有助于HOXA基因时间共线激活所需的三维染色质组织变化。我们表明，不同的HOTAIRM1变异体优先与UTX/MLL或PRC2复合物相关，以调节二价结构域激活和沉默标记的水平。HOTAIRM1有助于簇近端染色质环的物理分离，延迟组蛋白去甲基化酶UTX的募集和中心HOXA基因的转录。有趣的是，我们发现在不同的细胞类型中，HOAIRM1在没有染色质构象变化的情况下激活了HOXA基因的整体近端。我们的结果揭示了染色质结构、结构和lncRNA功能之间以前未被认可的关系。

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数字

图1。
图1。
这个酒店1RA处理NT2-D1细胞时，lncRNA基因高度诱导。(A类)的线性图霍克萨语本研究检测了基因簇区域。这个霍克萨语基因以左箭头表示，以指示转录方向，并用彩色编码，以便于整个研究过程中的数据解释。指向右侧的红色箭头表示之前报告的基因间lncRNA的TSS。人类7号染色体上lncRNA的基因结构和基因组位置如所示(B类). 这个霍克萨语(C类)和lncRNA(D类)在NT2-D1细胞中，10μM RA处理可诱导簇的3΄（近端）部分的基因。基因表达通过RT-qPCR测定，并与肌动蛋白相关。用于定量的引物序列见补充表S1。(E类)3`（左）和5`（右）的表达式霍克萨语聚类基因如（C）所示。RT-qPCR值和标准偏差见补充表S2。(F类)Northern blot分析显示RA诱导后NT2-D1中未分裂和剪接HOTAIRM1的稳定表达。预测的HOTAIRM1转录变体图如所示(克). (H（H）)细胞质hsp90和核层粘连蛋白A/C的蛋白质印迹显示了细胞分离方案的质量。(我)未片段化和拼接的HOTAIRM1总转录本如（C）所示，并显示在核MALAT-1和细胞质GAPDH转录本旁边，以进行比较。细胞核和细胞质中未分裂和剪接HOTAIRM1的百分比见(J型)其次是MALAT-1、GAPDH和肌动蛋白，用于质量控制。用于量化HOTAIRM1变体的区域在（G）中用绿线表示。E；外显子。我；内含子。此图中的所有RNA表达测量值均来自三个生物复制品中的至少三个PCR，误差条表示标准偏差。
图2。
图2。
HOTAIRM1调解相反霍克萨语特定细胞类型的基因调控。(A类)NT2-D1中未拼接（左）和拼接（右）HOTIARM1变体的示意图。灰色（顶部）和鲑鱼（底部）线分别表示RT-qPCR定量和RNAi靶向转录物的区域。(B类和C类)使用siRNAs对HOTAIRM1进行RNAi敲除。稳态HOTAIRM1和3΄的RT-qPCR分析霍克萨语对照（siGFP）和HOAIRM1（siM1-1/2）敲低细胞中的转录物用10μM RA诱导72小时。与（B）中肌动蛋白相关的表达水平显示了两组之间稳态表达水平的差异霍克萨语基因。折叠RNA变化（C）与siGFP控制设置为1有关。(D类和E类)与（B和C）中的相同，只是敲除是用短发夹RNA控制（shControl）或HOTAIRM1（shM1）进行的。所有RNA表达测量均来自三个生物复制品中至少三个PCR，误差条代表标准偏差。
图3。
图3。
RA-诱导的三维染色质组织改变需要HOTAIRM1霍克萨语在NT2-D1细胞中聚集。(A类和B类)RA诱导三维染色质组织改变霍克萨语在NT2-D1细胞中聚集。（A） 沿线的物理接触霍克萨语用5C-seq在未诱导（0h RA；补充表S7）和RA诱导（72h RA；辅助表S8）细胞中测量聚类。根据底部显示的色标，成对交互频率（IF）以热图形式显示（10 kb箱子，10 kb平滑，2×步长）。这个霍克萨语区域显示为在两种条件之间缩放。（B） 与RA治疗相关的染色质接触变化（顶部）根据右侧的刻度以热图形式显示。热图值表示72小时RA和0小时RA治疗之间的IFs差异。蓝色值表示感应后失去接触，红色值表示相互作用增加。将簇分为两部分的黑色虚线突出显示了TAD边界的位置。5C染色质相互作用曲线酒店1沿着霍克萨语未诱导（0 h）和RA诱导（72 h）细胞中的簇（底部）。交互频率(y轴; 标准化5C读取计数）与酒店1发起人(x轴). 循环区域以黄色高亮显示。(C类和D类)之间失去回路触点酒店1-受调控基因需要NT2-D1中的lncRNA。（C） 5C-seq分析霍克萨语对照组（shControl 72 h RA；补充表S11）和HOTAIRM1缺失细胞（shM1 72 h RA，补充表S12）。（D） 与shRNAs缺失HOTAIRM1相关的染色质接触变化（顶部）和酒店1染色质与霍克萨语集群（底部）如面板B所述。
图4。
图4。
NT2-D1细胞中HOTAIRM1的耗竭改变了RA触发的H3K4me3和H3K27me3水平的变化。(A类)3΄霍克萨语RA处理NT2-D1细胞时，簇基因被强烈诱导。数值低于水平虚线的测量值表示量化不可靠的测量值。基因表达通过RT-qPCR进行测量，测量来自三个生物复制品中至少三个PCR。误差线表示标准偏差。(B类)霍克萨语簇是未经处理的NT2-D1细胞中转录沉默的二价结构域。使用ChIP-seq测量H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3标记。显著的峰值显示为轨道上方的彩色矩形。这些数据集及其匹配输入来自UCSC浏览器，如“材料和方法”部分所示。(C类)用于通过RT-qPCR分析面板中H3K4me3或H3K27me3丰度的PCR扩增子位置D–G型这里显示的ChIP结果来自于图2D和E中为基因表达分析的相同三个生物复制。（D） NT2-D1细胞中RA的诱导伴随着基因体中沉默的H3K27me3标记的急剧减少。（E） RA治疗NT2-D1后H3K4me3启动子水平在HOXA1型和A2类基因。（F） 3΄霍克萨语在HOTAIRM1基因敲除中高表达的基因在其基因体中显示出较少的H3K27me3。（G） 3HOXA1型和A2类在HOTAIRM1敲除中表达较少的基因在其启动子处的H3K4me3较少。测量值以输入的百分比表示，来自三个生物复制品中至少三个PCR。误差条表示平均值的标准误差（sem）。用于定量的引物序列见补充表S5。
图5。
图5。
未拼接HOTAIRM1与激活UTX/ASH2L和沉默PRC2复合物与拼接形式的优先关联(A类)NT2-D1中未分割（左）和拼接（右）HOTAIRM1变体的线性图。灰色线（顶部）表示用于RT-qPCR定量的区域(B类和C类). E；外显子。我；内含子。（B） RA诱导的NT2-D1核提取物中的UTX RIP。（C） Suz12 RIP在RA诱导的NT2-D1核提取物中的表达。RIP测量值以输入的百分比表示，来自三个生物复制品中至少三个PCR。(D类和E类)对照组（IgG）、UTX和Suz12 RIP样本的Western blot分析表明，在NT2-D1细胞中，UTX/MLL复合物与PRC2有明显区别。(F类)更高的UTX绑定到霍克斯4-7在RA诱导的HOTAIRM1-depleted NT2-D1细胞中。ChIP-RT-qPCR结果来自三个生物复制品，误差条代表平均值的标准误差（sem）。用于ChIP的引物序列见补充表S5。
图6。
图6。
HOTAIRM1如何调节霍克萨语NT2-D1细胞中的基因。该模型表明HOTAIRM1如何促进近端共线激活霍克萨语基因通过调节空间染色质组织和组蛋白修饰复合物的分布。
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