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.2017年1月；6（1）:139-150。
doi:10.5966/sctm.2015-0422。 Epub 2016年8月29日。

人神经前体细胞Ferumoxytol标记用于猪脊髓磁共振诊断细胞追踪

杰森·拉曼纳 1 2, 胡安马可·古铁雷斯 1, 林赛·N·乌尔基亚 1, C维克托·赫蒂格 1, 埃尔曼·阿马多 2, 娜塔莉亚·格林 1, 克莱夫·N·斯文森 三, 泰斯·费德里奇 1, 约翰·奥辛斯基 2 4, 尼古拉斯·M·布利斯 1 2
附属公司

人神经前体细胞Ferumoxytol标记用于猪脊髓磁共振诊断细胞追踪

杰森·J·拉马纳等。 干细胞Transl Med. 2017年1月.

摘要

我们报道了基于磁共振成像（MRI）跟踪移植到猪脊髓中的ferumoxytol标记的人神经祖细胞（hNPCs）的诊断能力。用两种剂量的ferumoxytol纳米粒子（hNPC-F）预先标记hNPC低和hNPC-F高)被注射到健康小型猪的脊髓腹角。在移植后105天内，使用MRI在体内跟踪标记了Ferumoxytol的移植物。在移植后14天在体内评估注射准确性，并通过组织学评估“开”或“关”靶细胞移植物的位置。通过定量体视学评估，hNPC-F之间的长期细胞存活率没有差异低，hNPC-F高或控制移植物。组织学铁与MRI信号共定位，植入人细胞核。此外，ferumoxytol标记的细胞保留了纳米粒子并在体内发挥作用。该方法通过提供评估移植准确性、给药剂量和潜在细胞存活率的方法，朝着促进细胞追踪技术转化为临床试验的方向迈出了重要一步。干细胞转化医学2017；6:139-150.

关键词：细胞移植；临床翻译；体内跟踪；磁共振成像；神经干细胞；清管器模型；脊髓；干细胞移植。

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数字

图1
图1
ferumoxytol纳米粒子的细胞内化。所示为普鲁士蓝（PB）细胞铁细胞化学染色的代表性光学显微镜图像，以及未标记人类神经前体细胞（hNPC）的核固红复染（A），hNPC‐ferumoxytol（F）低标记细胞（B）和hNPC‐F高标记细胞（C），带有高倍图像（插图）。在靠近ferumoxytol标记细胞细胞核的细胞质中观察到典型的氧化铁纳米颗粒蓝色沉淀，并用ImageJ量化标记细胞的百分比。各组hNPC‐F分别为53.3%和77.2%，差异显著低和hNPC‐F高分别用ferumoxytol标记的细胞（D）hNPC‐F的透射电子显微镜低和hNPC‐F高细胞（E）揭示了大量含铁、电子密集的内体（F）含有纳米颗粒（G）.用PB比色消化法计算了ferumoxytol纳米粒子中的铁的细胞浓度。hNPC‐F的1.46和2.82ρg铁/细胞存在显著差异低和hNPC‐F高分别为（H）.比例尺=10μm，×40（A–C）; 10μm，×100（插图）；3微米（E）; 0.3微米（F）; 和50纳米(G公司). 图表显示为平均值±SD。**，在以下位置有效对< .005; ∗∗∗, 重要时间对< .0005. 缩写：F，ferumoxytol；人神经祖细胞；ns，不显著。
图2
图2
费莫氧醇标记后的体外细胞活力和功能。台盼蓝排除试验（A）和流式细胞术用AquaBlue进行活/死染色（B）各组间细胞活力无变化。MTT细胞代谢试验显示，使用ferumoxytol标记后，细胞代谢显著增加（C）细胞抗原β2微球蛋白的流式细胞术直方图（D）和人类白细胞抗原-DR（E）ferumoxytol标记的表达无变化。未标记人类神经前体细胞（hNPC）免疫细胞化学染色的代表性图像（F），hNPC‐ferumoxytol（F）低标记细胞（G）和hNPC‐F高标记细胞（H）表达星形细胞标志物GFAP（红色）和神经元标志物βT3（绿色）。在hNPC和hNPC‐F之间观察到星形细胞分化增加，同时神经元分化减少高条件，但不在未标记的hNPC和hNPC‐F之间低 （I，J）.比例尺=×40，10μm（F–H）.图表显示为平均值±SD.*，有效值为对<.05；***，重要时间对< .0005. 缩写：βT3、βIII微管蛋白；DAPI，49,6-二氨基-2-苯基吲哚；F、 阿魏醇；胶质纤维酸性蛋白；人类白细胞抗原；HLA‐DR，人类白细胞抗原D相关；人神经祖细胞；最大值，最大值；MTT，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵；ns，不显著。
图3
图3
在猪脊髓3T处对费莫氧醇标记移植物进行体内跟踪和定量。未标记人神经前体细胞（hNPC）和ferumoxytol标记hNPC‐F的个体移植物低和hNPC‐F高用稳定的立体定向注射系统将细胞双侧移植到猪脊髓内。hNPC‐F公司高细胞移植物被移植到头端脊髓段，未标记的hNPC移植物被植入中心段，hNPC‐F低将移植物移植到尾段，共注射12次，每次2.5×105每个单元格（A）低信号病灶，代表hNPC‐F低‐和hNPC‐F高术后第14天，在典型的冠状T2*加权重建中观察到标记细胞移植物（B）未显示未标记的细胞移植物。hNPC‐F的典型轴向T2*加权图像高 （C）和hNPC‐F低 （D）用连续磁共振成像追踪移植物（白色箭头）长达105天。计算所有hNPC‐F的移植物体积高 （E）和hNPC‐F低 （F）在所有时间点移植。显示了以每个时间点的平均信号强度表示的汇总数据。在第14天和其他时间点之间观察到信号空泡容积显著下降，但在第63天之后hNPC‐F没有变化高移植物（E）hNPC‐F在第28天后未观察到显著变化低移植物（F）图显示为平均值±标准偏差对<0.0005。缩写：Cor，冠状；F、 阿魏醇；人神经祖细胞hNPC；MR、磁共振；ns，不显著；POD，术后天数。
图4
图4
ferumoxytol标记细胞移植物的诊断性磁共振成像（MRI）可预测靶向/非靶向移植部位。T2*加权轴向MR图像（A）显示两者都符合目标（B）和偏离目标（C）ferumoxytol标记的人神经前体细胞（hNPC‐F）高脊髓内移植（箭头，标记对应于面板B和C）。“目标”代表（B）和“偏离目标”（C）hNPC‐F的显微照片高显示了人类核抗原（黑核）染色的细胞移植物。“靶向”被定义为超过50%的细胞移植物接触含有运动神经元的腹角。三名盲人专家观察员回顾了两例hNPC‐F的T2*加权MR图像低和hNPC‐F高细胞移植。hNPC‐F的T2*加权MRI诊断回顾低移植物对预测“开”或“关”靶移植物的敏感性为86.7%，特异性为93.3%。hNPC‐F的MRI高细胞移植预测靶向性的敏感性为86.7%，特异性为80.0%。比例尺=×4，1 mm。缩写：F，ferumoxytol；人神经祖细胞；MRI、磁共振成像。
图5
图5
死后在猪脊髓中发现了Ferumoxytol标记的细胞移植物。移植后105天，含有人类神经祖细胞（hNPC）未标记移植物的区域的典型T2*加权磁共振（MR）图像显示无低信号病灶（A）.来自具有代表性的ferumoxytol标记的hNPC（hNPC‐F）的代表性MR图像低 （B）和hNPC‐F高 （C）细胞移植物显示低强度病灶（白色箭头），代表了阿鲁莫醇产生的阴性对比。计算终末点105天时所有移植物的MR信号空腔容积（D）显示了hNPC的普鲁士蓝铁染色的代表性显微照片（E），hNPC‐F低 （F）和hNPC‐F高 （G）细胞移植物。hNPC‐F中观察到典型的蓝色沉淀低和hNPC‐F高细胞移植物。定量了移植物特异性组织铁（H）hNPC人类核抗原染色的代表性显微照片（一） ，hNPC‐F公司低 （J）和hNPC‐F高 （K）显示了细胞移植。雕刻用体视学定量（左）.比例尺=×2，1 mm；×20，50μm（插图）。图表显示为平均值±SD。图表D、H和L上的个别数据点来自术后第105天的个别移植物，并按动物进行颜色编码。*，重要时间对< .05; ∗∗∗, 重要时间对< .0005. 缩写：F，ferumoxytol；人神经祖细胞；HuNu，人类细胞核；MRI、磁共振成像；ns，不显著；PB，普鲁士蓝。
图6
图6
Ferumoxytol仍被移植的人类神经祖细胞内吞。3,3′-二氨基联苯胺（DAB）-人类细胞核阳性、移植的阿魏醇标记人类神经前体细胞（hNPC‐F）的典型透射电子显微镜图像高)（A）术后第42天发现大量含铁、电子密度高的内体（插图）。DAB-普鲁士蓝联合染色的人细胞核显示铁沉淀（箭头）和人细胞核（箭头）的共定位（B）术后105天。在人体细胞外也观察到铁沉淀（星号），但密度较低。定量HuNu+细胞与PB+沉淀物共定位的百分比用于计算标记hNPC‐F的百分比低 （C）和hNPC‐F高 （D）术后第28、42和105天的细胞移植。“中心”是指细胞移植的核心，“外围”是指从移植核心迁移200μm或更大的细胞。比例尺=2μm（A）; 100 nm（插入）；和×40,25μm（B）.*，在对< .05; ∗∗, 重要时间对< .005; ∗∗∗, 重要时间对< .0005. 缩写：F，ferumoxytol；人神经祖细胞；HuNu，人类细胞核；PB，普鲁士蓝。
图7
图7
移植的ferumoxytol标记的人类神经前体细胞在猪脊髓中分化。用小鼠单克隆抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（绿色）和兔多克隆抗人巢蛋白抗体（红色）在未标记人类神经前体细胞（hNPC）中进行免疫组织化学染色的代表性荧光显微图（A），ferumoxytol‐标记hNPC‐（F）低 （B）和hNPC‐F高 （C）术后105天的移植物用高倍镜显示。用49,6-二氨基-2-苯基吲哚染色（蓝色）观察所有细胞核。从每种情况下选择5个植入率>10%的移植物进行分析。在对侧或排斥移植物中未观察到GFAP+或nestin+信号。未标记hNPC的高倍图像(D类)，hNPC‐F低(E类)和hNPC‐F高(F类)表达人类细胞核（HuNu+）（绿色）和Ki67+（红色）的细胞移植物显示很少增殖的移植细胞（实心箭头）。未标记hNPC的高倍图像（G），hNPC‐F低 （H）和hNPC‐F高 （一）表达HuNu+（绿色）和裂解caspase‐3（CC3）（红色）的细胞移植物显示很少有凋亡的移植细胞（开放箭头）。计算所有组GFAP+和nestin+的相对表达（J‐L）计算HuNu+和Ki67+的相对表达（百万），就像HuNu+和CC3之间的情况一样（N）.比例尺=×4500μm（A‐C）; ×100，10微米（A‐C）（插图）；×40，25微米（D‐I）图显示为平均值±标准偏差。缩写：CC3，裂解半胱天冬酶3；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；F、 阿魏醇；胶质纤维酸性蛋白；人神经祖细胞；HuNu，人类细胞核；ns，不显著。
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参考文献

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