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.2017年1月；6(1):77-87.
doi:10.5966/sctm.2016-0040。 Epub 2016年8月5日。

髌下脂肪垫作为再生医学中软骨生成潜能增加的血管周围干细胞来源

保罗·欣德尔 1, 努斯拉特·汗 1, 利拉·比安特 1, 布鲁诺·佩奥 1
附属公司

髌下脂肪垫作为再生医学中软骨生成潜能增加的血管周围干细胞来源

保罗·欣德尔等。 干细胞Transl Med. 2017年1月.

摘要

血管周围干细胞（PSCs）是间充质干细胞（MSCs）的天然祖先，是负责体内稳态和修复的干细胞。经前瞻性鉴定和分离的PSC显示其可塑性和成骨潜能增加。与皮下脂肪细胞相比，髌下脂肪垫（IFP）细胞的成软骨潜能增加。本研究评估了IFP-PSC与来自IFP和骨髓的MSCs相比的成软骨潜能。免疫组织化学显示血管周围标志物（CD146、CD34、神经/胶质抗原2[NG2]、血小板衍生生长因子受体-β[PDGFRβ]和α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]）相对于内皮标志物（CD31、CD144、血管性血友病因子[vWF]）的位置。用流式细胞术从基质血管部分（分别为3.8%和21.2%）分离出周细胞和外膜细胞，存活率为88%。分离的周细胞和外膜细胞平均数为4.6±2.2×104和16.2±3.2×104分别等于7.9±4.4×10三和20.8±4.3×10三每克收获组织中的细胞数。荧光活化细胞分选显示培养的PSC为CD44+CD90+CD105+；聚合酶链反应和免疫细胞化学表明周细胞保留其CD146+表型，并表达周细胞标记物PDGFRβ和NG2。通过组织化学染色和基因表达确认分化。使用颗粒模型，IFP PSC和MSCs产生的细胞外基质明显多于骨髓MSCs（分别为p<0.001和p=0.011）。IFP-PSC产生的细胞外基质明显多于IFP-MSCs（p=0.002）。微体培养表明，与MSCs相比，分化PSC的COL2A1、ACAN和SOX9表达分别上调了4.8±1.3、4.3±0.9和7.0±1.7倍。与骨髓相比，IFP是软骨生成干细胞的更好来源。PSCs产生的细胞外基质明显多于培养衍生MSCs。干细胞转化医学2017；6:77-87.

关键词：脂肪；成体干细胞；CD34+；软骨发生；周细胞。

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数字

图1
图1
髌下脂肪垫的位置和样本。（A） 以下为：膝关节的矢状磁共振成像扫描显示髌下脂肪垫（IFP；白色）与关节软骨（黑色）的关系。（B、C）：膝关节置换术患者切除的IFP（B）从纤维组织中去除脂肪（C）.（D、E）：关节镜下收获的脂肪垫（D）在酶消化之前从灌溉液中分离出来（E）.
图2
图2
髌下脂肪垫的免疫组织化学和组织学。切片显示血管周围α平滑肌肌动蛋白染色（A），CD146（B、D–F），NG2（C），CD34（D–F）和PDGFRβ（G）.（B、C、E–G）：显示了与内皮标记物CD31和vWF的关系。（D–F）：证明了CD146和CD34的位置。（H，I）：切片被Picrosius红色染色（H）苏木精和曙红（一）展示血管周围结构（H，I）以及滑膜（一）DAPI用于核染色，在所有图像中显示为蓝色。比例尺=200μm（A、C、F）; 50微米（B、D、E、G）; 400微米（H）; 和300微米（一）缩写：aSMA，α‐平滑肌肌动蛋白；神经/胶质抗原2；血小板衍生生长因子受体PDGFRβ；vWF、von Willebrand因子。
图3
图3
血管周围干细胞的流式细胞术分离。（A） ：荧光激活细胞分类图像显示了用于分离血管周围干细胞的门控策略。根据单个细胞的大小和相对尺寸选择可能代表单个细胞的事件，然后使用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；顶行）排除死细胞。根据CD31和CD45的表达，分别排除内皮细胞和造血干细胞（左下）。用于选择周细胞（CD146+CD34−）和外膜细胞（CD147−CD34+；中下部）的Gates基于同型对照（右下部）。（B） ：对接受ACL重建或TKR的患者使用荧光激活细胞分选法分选的周细胞、外膜细胞和血管周干细胞的平均数量进行了比较。（C） ：比较接受ACL重建或TKR的患者每克组织中分选的细胞数。（D） ：比较基质血管部分中周细胞或外膜细胞的活细胞百分比。缩写：ACL，前交叉韧带；APC，别藻蓝蛋白；Cy7，花青素7；异硫氰酸荧光素；PE，藻红蛋白；SSC‐A，侧面散射面积；SSC‐H，侧面散射高度；TKR，全膝关节置换术。
图4
图4
培养血管周围干细胞的特性。（A） ：用流式细胞术分析培养的周细胞、外膜细胞和混合血管周干细胞的间充质和PSCs标记物的表达；从左到右：CD44、CD90、CD105、CD146、CD34。（B） ：用免疫细胞化学方法分析培养的周细胞，寻找与周细胞相关的抗体（顶行）。对照组省略了主要抗体（最下面一行）。（C） ：使用逆转录聚合酶链式反应对培养的周细胞进行基因分型。比例尺=400μm。缩写：FITC，异硫氰酸荧光素；神经/胶质抗原2；血小板衍生生长因子受体-β；PE，藻红蛋白；PSC，血管周围干细胞。
图5
图5
成骨和成脂分化。（A） ：与MSC对照组相比，PSC的成骨分化显示茜素红染色增强。（B） ：与生长介质对照组相比，PSCs和MSCs的脂肪分化显示细胞内小泡增多，油红O染色阳性。（C） ：分化细胞表达RUNX2、ALPL和BGLAP；ACTB公司作为参考基因。（D） ：分化细胞表达PPARG；ACTB公司作为参考基因。比例尺=50μm。用于多聚酶链反应图像的通道，从左到右：1、前交叉韧带（ACL）周细胞；2、ACL外膜细胞；3、ACL混合PSC；4、全膝关节置换术（TKR）周细胞；5、TKR外膜细胞；6、TKR混合PSC；7、ACL MSC；8、TKR MSC；9、骨髓源性MSCs；补充脱氧核糖核酸阴性对照。缩写：MSC，间充质干细胞；PSC，血管周围干细胞。
图6
图6
PSCs的软骨分化。使用颗粒物确认软骨发生（A、B）和微质量（C、D）阿尔西安蓝染色显示的模型（A、C）硫酸化蛋白聚糖和苦味酸红（B、D）胶原蛋白I和II。（E） ：颗粒（白色箭头）和微型块（粉红色箭头）之间的外观存在宏观差异。（F） ：与脂肪垫和骨髓中的间充质干细胞相比，PSC产生的颗粒明显更大。软骨生成标记物的相对基因表达表明髌下脂肪垫（IFP）PSCs的COL2A1表达更高（G），SOX9（H）和ACAN（一）以及COL2A1与COL1A1的比率增加（J）与IFP MSC相比。比例尺=400μm（A–D）缩写：Adv、Advential；ASC，脂肪衍生干细胞；BM‐MSC，骨髓源性间充质干细胞；血管周围干细胞；PSR，苦味酸红染色。
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