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.2017年3月24日;292(12):5089-5100。
JBM17513.10.10号文件。 Epub 2017年2月6日。

热休克诱导MAPK/ERK激酶磷酸化焦油DNA结合蛋白43(TDP-43)调节TDP-43功能

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热休克诱导MAPK/ERK激酶磷酸化焦油DNA结合蛋白43(TDP-43)调节TDP-43功能

李文等等。 生物化学杂志. .
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摘要

TAR-DNA结合蛋白(TDP-43)是一种高度保守和必需的DNA和RNA结合蛋白,通过RNA处理,特别是剪接的调控来控制基因的表达。TDP-43的细胞内聚集是肌萎缩性侧索硬化和泛素阳性额颞叶变性的标志。这种TDP-43病理也存在于其他类型的神经退行性变,包括阿尔茨海默病。我们在这里报告TDP-43是MEK的底物,MEK是MAPK/ERK信号通路中的一个中心激酶。热休克反应(HSR)可显著提高人细胞TDP-43在苏氨酸153和酪氨酸155(p-T153/Y155)的双重磷酸化。HSR通过维持蛋白质稳态和防止蛋白质错误折叠来促进蛋白质毒性条件下的细胞存活。MEK被HSR激活,参与调节蛋白质组的稳定性。磷酸化的TDP-43与TDP-43聚集无关,并且p-T153/Y155在促进蛋白质错误折叠的条件下仍然是可溶的。我们发现,活性MEK显著改变TDP-43调节的剪接,并且这两个残基的仿磷酸取代减少了与富含GU的RNA的结合。使用磷酸化特异性p-T153/Y155抗体的细胞成像显示磷酸化的TDP-43被特异性地招募到核仁中,这表明p-T153/Y155调节了TDP-43在处理核仁相关RNA过程中的一个先前未被重视的功能。这些发现强调了一种通过磷酸化调节TDP-43功能和体内平衡的新机制,因此,可能有助于开发防止TDP-43聚集的策略,并揭示TDP-43在细胞代谢中的作用。

关键词:MEK激酶;RNA结合蛋白;RNA蛋白相互作用;TAR-DNA结合蛋白43(TDP-43)(TARDBP);肌萎缩性侧索硬化(ALS)(Lou-Gehrig病);热休克反应;神经退行性变;蛋白质聚集。

利益冲突声明

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数字

图1。
图1。
热休克诱导TDP-43在Thr-153和Tyr-155处磷酸化。 答:,示意图显示与蛋白质活性和结构相关的TDP-43结构域:核定位序列(NLS公司)在N端,rrm1和2,低复杂度序列在C端。苏氨酸153和酪氨酸155(红色)在RRM1中突出显示插入。B组,与富含UG的RNA分子结合的TDP-43rrm1-2片段(氨基酸102-269)的带状和表面表达(灰色)根据络合物(36)的核磁共振结构。Thr-153和Tyr-155在红色。C组,热休克(43°C)30分钟;亚砷酸钠(0.5 m)处理的SH-SY5Y细胞的免疫印迹1小时(NaAsn);h2O2,100μ5小时;羟基脲,4米持续4小时()放线菌素D,5μg/ml,作用3h(D幕).D,从对照组和热休克处理的SH-SY5Y细胞获得的细胞裂解产物的免疫印迹。以识别总磷酸化非依赖性TDP-43的抗体作为对照。以微管蛋白和GAPDH作为负荷对照。
图2。
图2。
抗体p-T153/Y155-TDP-43特异性检测热休克介导的TDP-43磷酸化。 答:,用TDP-43特异性和对照siRNA处理HeLa细胞,比较热休克应激后p-T153/Y155-TDP-43水平。误差线,S.D。n=4。B组,用与在Thr-153和Tyr-155(T153)磷酸化的Thr-153/Tyr-155区域(氨基酸148–161)相对应的TDP-43肽阻断的p-T153/Y155-TDP-43抗体检测SH-SY5Y细胞裂解物中的热休克相关信号P/155日元P)或与相应的非磷酸化肽作为对照。两种浓度的肽被使用低()而且很高(H),在“实验程序”下描述C组,p-T153/Y155-TDP-43检测对照组和经λ-磷酸酶处理的SH-SY5Y细胞裂解物。
图3。
图3。
p-T153/Y155-TDP-43检测到TDP-43在致密螺旋状结构中的核仁定位。 答:,未处理HeLa细胞的荧光显像显示总TDP-43和p-T153/Y155-TDP-43定位。B组,在显微镜下观察到细胞内的纤维化。C组,在检测到热休克后的对照组中,与对照组的细胞进行比较。酒吧,10μm。
图4。
图4。
p-T153/Y155与TDP-43的聚集、应激颗粒募集或清除无关。 答:,对SH-SY5Y细胞进行分离,用对照、热休克处理的细胞(43°C持续30分钟),并使细胞在37°C下恢复1或2小时(1小时R,2小时R)热冲击后。总裂解物的免疫印迹(),里帕(R),和尿素(美国)可溶性组分检测p-T153/Y155和总TDP-43。相同体积的总裂解物和RIPA可溶部分被装载,而尿素部分的浓度是原来的5倍。B组,UPS抑制剂MG132(20μm)对SH-SY5Y细胞的免疫印迹分析5小时),热休克(HS:43°C,30分钟),海藻糖(100 m24小时),thapsigargin(THP:1μ血清饥饿(24小时)。C组,对照组和热休克处理HeLa细胞的荧光显微镜检测p-T153/Y155和应激颗粒标记物TIAR。箭头表示TIAR正应力颗粒。D,治疗组和对照组分别为132μmGA和,5小时)。箭头表明TDP-43胞浆聚集物检测到磷酸非依赖性抗体。酒吧,10μm。E,对照组和海藻糖(100 m24小时)处理HeLa细胞。自噬小泡的形成(箭头,下部面板)转染GFP融合微管相关蛋白1A/1B轻链3后可见(LC3区).酒吧,25微米。
图5。
图5。
TDP-43被MEK在Thr-153/Tyr-155处磷酸化。 答:,围绕Thr-153和Tyr-155的人TDP-43氨基酸序列(下划线的)与人ERK1激活环序列一致,其中MEK在Thr-202和Tyr-204处磷酸化(下划线的).B组,热休克和对照处理的HEK-293和SH-SY5Y细胞的免疫印迹。显示了磷酸化独立蛋白的水平,并用微管蛋白作为负荷控制。C组,用特异性MEK抑制剂PD184352(10μ)处理SH-SY5Y细胞)和PD98059(50μ),并与下游激酶ERK FR180204(30μ). 热处理后细胞暴露于热处理1h。D,蛋白磷酸酶PP1/2A抑制剂冈田酸(0.5μg)对SH-SY5Y细胞的作用),与MEK抑制剂PD184352联用1h后热休克。E,p-T153/Y155水平分析了在没有热休克的情况下SH-SY5Y细胞中组成性活性GFP-MEK_-DD突变体和GFP对照结构的表达。
图6。
图6。
Thr-153/Tyr-155处的仿磷取代可调节TDP-43的活性。 答:,CFTR外显子9小基因细胞报告TDP-43活性示意图。外显子和内含子区域表示为线分别是。TDP-43绑定到UG重复(UG13)3′剪接位点附近抑制第9外显子内含物。拼接的两个主要产品展示给正确的。B组,rna干扰抗性(siRes)TDP-43突变体在siRNA处理的HeLa细胞中表达。比较野生型父系,计算相对TDP-43活性。以RNA结合缺陷突变体F147L/F149L作为对照。误差线,S.D。,n>5。C组,在siRNA或对照处理细胞中表达的组成性活性MEK_-DD或对照GFP载体。报告活性与野生型父系(WT)相关先生). 数值代表独立转染实验的平均值。误差线,S.D。,n≥4个。
图7。
图7。
荧光法测定TDP-43rna与GU重复序列的结合亲和力。 答:,固有荧光(F)用A(UG)滴定重组TDP-436在没有RNA的情况下用荧光归一化RNA(F0). 所示为F/F0根据“实验程序”中的方程式1和2,分析了四种不同TDP-43浓度和数据下的值。表观平衡解离常数的最佳拟合值为,Kd(应用程序),如表1所示。B组,全长TDP-43示意图,突出显示RRM1中的Trp-113和Trp-172。下面板显示了102-269片段与富含GU的RNA(36)结合的表面和带状结构。RRM1中的色氨酸残基在洋红.

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