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.2017年3月1日；10(3):337-348.
doi:10.1242/dmm.027268。 Epub 2017年2月2日。

咪康唑保护血管免受MMP9依赖性破裂和出血的影响

冉扬（音） 1 2, 张云培 3, 黄丹丹 3, 小罗 2, 张良仁 2, 朱晓军 1 2, 张晓林 4, 刘振明 5, 韩京燕 6, 熊靖伟 7 2
附属公司

咪康唑保护血管免受MMP9依赖性破裂和出血的影响

冉扬（音）等。 Dis模型机械. .

摘要

出血性中风占所有中风的10-15%，与世界各地的死亡率和发病率密切相关，但其预防和治疗干预仍然是一个重大挑战。在这里，我们报告了通过小分子筛选在斑马鱼中鉴定咪康唑为出血抑制剂。我们发现一个低形态突变体fn40安，其中一个已知β-pix斑马鱼突变等位基因与出血性脑卒中患者一样，具有脑出血、血管破裂和炎症等主要症状。一个带有突变胚胎的小分子筛选鉴定出抗真菌药物咪康唑是一种有效的出血抑制剂。咪康唑通过减少基质金属蛋白酶9（MMP9）依赖性血管破裂抑制斑马鱼脑出血和大鼠肠系膜出血。在机械方面，咪康唑下调pErk和Mmp9的水平，以保护血管完整性fn40安突变体。因此，我们的研究结果表明，咪康唑通过下调斑马鱼到哺乳动物的pERK-MMP9轴来保护血管免受出血，并揭示了斑马鱼表型筛选用于发现出血性中风新候选药物和化学探针的潜力。

关键词：化学筛；出血；咪康唑；Mmp9；中风；斑马鱼。

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作者声明没有竞争或财务利益。

数字

图1。
图1。
这个fn40安突变体是出血性中风模型适用于斑马鱼的化学抑制剂屏蔽。（另请参见图S1、S2). （A-D）野生型兄弟姐妹的实时图像（A，B）和纯合子fn40安突变体（C，D）2 dpf；注意突变体中有明显的脑出血（箭头）。A、 C：侧视图；B、 D：背视图。（E-L）的实时图像Tg（千克）(flk1（飞行高度1）：eGFP）；Tg（千克）(盖塔1：DsRed）野生型同胞（E、F、I、J）和fn40安突变体（G，H，K，L）在2 dpf。注意那个盖塔1+红细胞泄漏来自Tg(flk1（飞行高度1）：eGFP）-标记的血管和形状突变体（G-H，K；箭头）中的血肿，而红细胞仍然存在野生型同胞（E、F、I）的血管内。玻璃钢(冠1a：eGFP）标记的巨噬细胞和中性粒细胞在该突变株的出血部位积聚（L，箭头）而白细胞均匀分布在野生型同胞胚胎（J）2 数字功率因数(n个>8） 。（M） 化学滤网概述突变胚胎排列在96周的培养皿中并用二甲基亚砜处理或化合物，说明咪康唑抑制大脑与二甲基亚砜治疗相比，出血呈剂量依赖性。红色表示出血性突变体。
图2。
图2。
咪康唑抑制脑出血fn40安−/−突变体。（另请参见图S2-S4和表S1). （A-D′）O（运行）-dianisidine染色法显示红细胞脑背侧出血（C′）在纯合子中被咪康唑（mic）治疗（D′）抑制fn40安突变体，但无脑出血发生在杂合子中fn40安缺失的突变体或在2时出现咪康唑（mic）（A-B′） dpf。A-D、，腹视图；A′-D′，背视图。上的数字右下角显示出血（C，C′）和非出血（A-B′，D，D′）胚胎总数胚胎评分。BA和PHBC之间的（E-L）CtA标记在Tg（千克）(flk1（飞行高度1）：eGFP）斑马鱼受到干扰（G，K，箭头）在纯合子突变体中。这是通过麦克风治疗挽救的纯合子突变体中的（H，L）与具有DMSO或mic治疗（E-F、I-J）。图像代表了每组10个以上胚胎(n个>10). E-H、，2 dpf；I-L，3个 dpf。比例尺：50 微米。（M-T）透射电镜显示血液侵入细胞（红色箭头）和受损神经元（O）以及高密度血浆（红色星号）进入周围大脑组织（S）infn40安纯合子突变体。这是mic治疗（P，T）与杂合突变体的比较在2.5下进行或不进行mic治疗（M-N，Q-R） dpf。图像代表每组8个以上的胚胎(n个>8). 在Q-T中，虚线表示血液船舶边界；红色箭头表示侵入的血细胞；黄色的箭头表示细胞死亡后出现液泡。BA，基底动脉；CtA、，中央动脉；PHBC，原始后脑通道；RB，红血球细胞；Ne，神经元。比例尺：5 微米。
图3。
图3。
咪康唑预防脑出血Mmp9介导的血管破裂fn40安−/−突变体。（另请参见图S5). （A-D′）荧光免疫组化显示tight的可比表达Tg中的连接蛋白ZO1(flk1（飞行高度1）：eGFP）标记大脑野生型中使用或不使用咪康唑（mic）治疗的血管兄弟姐妹（A-B′）和fn40安突变体2时的（C-D′） dpf。图像代表了更多每组胚胎超过15个(n个>15） 。（E-L′）窦静脉微量注射DAPI神经元在之前被泄漏的DAPI染色（G，G′，箭头）在（K，K′，箭头）明显出血后，表明纯合子血管通透性增加fn40安突变体。这是通过麦克风治疗抢救出来的（H，H′，L，L′），与DAPI泄漏少得多无论是否接受mic治疗（E-F′，I-J′）。E-H′为1.5岁时的胚胎 dpf、I-L′为胚胎在2 dpf。右下角的数字显示胚胎总数中的表型胚胎得分。比例尺：100 微米。（M） 定量实时PCR鉴定基质金属蛋白酶9，但不是其他MMP基因，上调纯合子的fn40安突变体被抑制了经2dpf的mic处理，恢复到正常水平。*P（P）<0.05，通过双向方差分析Bonferroni后测试，与同胞DMSO组的每个基因进行比较；平均值±s.e.m.（N，O）Western blot（N）和qRT-PCR（O）已确认MMP9蛋白和基质金属蛋白酶9mRNA增加DMSO控制处理的突变体mic治疗，与有或无mic的野生型同胞相比2时的处理 dpf*P（P）<0.05 byBonferroni多重比较试验的单因素方差分析，平均值±s.e.m.从整个胚胎中提取总RNA不含蛋黄的全胚胎蛋白质。（P，Q）MMP9抑制剂I将纯合突变体的脑出血率抑制到50%（P） 其中，在活的突变胚胎中对脑出血进行评分用DMSO或MMP9抑制剂（Q）处理。*P（P）<0.05学生t吨-与对照组进行比较；平均值±标准误差。
图4。
图4。
咪康唑抑制uPA诱导的肠系膜出血胡扯。（A-C）既不是生理盐水（NS）也不是咪康唑（mic）5或10 mg/kg引起肠系膜出血2 对照组动物治疗后h。（D-F）uPA治疗导致肠系膜出血1至2 小时在NS（D）存在的情况下进行后处理（箭头）。这是通过在5或5时用咪康唑预处理抑制10 毫克/千克（E、F）。（G，H）出血的数量uPA治疗引起的斑点（G）和出血面积（H）为用5或10 mg/kg咪康唑与无咪康唑的NS对照组比较uPA处理*P（P）双向<0.05Bonferroni后测与基线的ANOVA比较(n个>5); 平均值±标准误差。
图5。
图5。
咪康唑改善uPA诱导的大鼠肠系膜血管的细胞外基质（ECM）。（A-F′）荧光免疫组化显示纤维状ECM结构，IV型胶原（Col）染色（红色），被uPA治疗（D，D′）阻断。这部分被救了5或10 mg/kg咪康唑（mic）治疗（E-F′），与未经uPA治疗的NS或NS-mic相比（A-C′）。（G-L′）荧光免疫组化显示纤维状ECM结构，层粘连蛋白染色（抗Lama1，红色），被uPA治疗中断（J，J′）。这在一定程度上是5人或10人获救 mg/kg mic（K-L′），与未经uPA治疗的NS或NS-mic（G-I′）相比。CD31型（绿色）用于标记肠系膜的内皮层血管和DAPI（蓝色）染色细胞核。的数量每组使用的动物超过5只(n个>5). 黄色箭头表示非特定E，E′和K，K′染色。比例尺：100 微米。
图6。
图6。
咪康唑通过MEK-ERK-MMP9抑制出血通路。（另请参见图S8). （A-F′）荧光大鼠肠系膜血管的免疫组织化学显示MMP9（红色）通过uPA处理（D，D′）在ECM中诱导。这是5人或10人获救 毫克/千克咪康唑（mic）（E-F′），与未经uPA治疗的患者相比（A-C′）。CD31（绿色）用于标记内皮层用DAPI（蓝色）染色细胞核。这个每组使用的动物数量超过5只(n个>5). 比例尺：100 微米。（G） Western blots证实uPA诱导的MMP9表达是通过mic预处理抢救。（H，H′）pErk增加纯合斑马鱼fn40安突变体（二甲基亚砜对照）麦克风（5 µmol/l），与24岁时使用DMSO或mic的野生型兄弟姐妹相比 马力（H） ●●●●。考马斯蓝染色显示蛋白质负荷（H′）。（I-L）对于mic，MEK抑制剂U0126和PD0325901均抑制纯合子脑出血fn40安突变体以剂量依赖的方式（I）。麦克风和PD0325901（J）或U0126（K）协同抑制该突变株的脑出血。咪康唑（3 µmol/l）和U0126(3 µmol/l）协同抑制pErk，as以及Mmp9英寸fn40安24岁的突变体 马力，与接受二甲基亚砜或咪康唑治疗的野生型同胞相比（五十） ●●●●*P（P）<0.05通过单因素方差分析Bonferroni多重比较试验（G、H、J、L）或双向Bonferroni后测与对照组的方差分析（I，K）；平均值±标准误差。；n个>50.
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