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.2017年1月26日；2（2）：e91377。
doi:10.1172/jci.insight.91377。

3D肺球作为评估抗纤维化药物的个性化和预测性多细胞模型

拉努·苏罗莉亚 1, 李富军 1, 郑旺（音） 1, 李华诗 1, 刘刚 1, 周勇（Yong Zhou） 1, 特蕾西·勒克哈特 1, 世宗裴 2, 刘瑞明 1, 苏纳德·兰加拉扬 1, 若昂·德·安德拉德 1 三, 维克托·桑尼科尔 1 三, Veena B安东尼 1
附属公司

3D肺球作为评估抗纤维化药物的个性化和预测性多细胞模型

拉努·苏罗莉亚等。 JCI洞察. .

勘误表in

摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种致命的进行性纤维化肺疾病，其特征是肺中存在侵袭性肌成纤维细胞。目前，只有两种FDA批准的药物（吡非尼酮和尼替达尼）用于治疗IPF。没有明确的标准来指导特定的药物治疗。不仅需要新的方法来预测个性化药物治疗，还需要筛选有望治疗IPF的新分子。我们开发了一个利用IPF肺组织侵袭表型的模型系统。这个体外三维模型使用患者的肺组织来形成肺球。肺小泡是一种三维球体，由来自原发性肺活检的细胞组成，包括反映患者体内原位细胞类型的肺细胞类型。我们测试了20名IPF患者和9名对照组患者的肺泡，以评估个别患者对抗纤维化药物的反应性。对相同患者的临床参数和结果进行随访。我们的结果表明，肺泡球模拟了肺部的微环境，可作为评估IPF患者抗纤维化药物反应性的个性化预测模型。

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数字

图1
图1。肺泡是由多种细胞类型和细胞外基质组成的三维结构。
(A类)髓球制备示意图。典型的相控显微图像。H&E染色的肺泡。比例尺：250μm。(B类)对IPF患者的肺泡进行免疫荧光染色，检测石蜡包埋切片中的α-SMA、SPC、CD31、CD11b、纤维连接蛋白-EDA、I型胶原和IV型胶原。所有免疫荧光玻片均与细胞核的DAPI共染。从每个对照受试者中随机抽取五个纸浆球(n个= 9). 比例尺：250μm。(C类)对IPF患者的肺泡进行免疫荧光染色，检测石蜡包埋切片中的α-SMA、SPC、CD31、CD11b、纤维连接蛋白-EDA、I型胶原和IV型胶原。所有免疫荧光玻片均与细胞核的DAPI共染。从每个IPF患者中随机抽取五个肺泡球(n个= 20). 比例尺：250μm。
图2
图2。肺泡中的细胞表型和蛋白质表达。
FACS分析分离的肺球细胞(A类)对照受试者(n个=9）和(B类)IPF患者(n个=20）对于CD11b和CD31（顶部），以及对于PE和AlexaFluor 647的SPC（底部）选通。PE-共轭异构体和AlexaFluor 647共轭异构体用作对照。每个对照受试者七个纸浆球(n个=9）和IPF患者(n个=20）用于FACS分析。SSC，侧面散射。(C类)来自3名IPF患者的3D和2D生长细胞中α-SMA和成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）表达的代表性蛋白质印迹。β-肌动蛋白作为负荷对照。(D类和E类)蛋白质印迹的定量密度测定(D类)α-SMA和(E类)FSP1。P（P）=0.02，与3D相比，未配对t吨测试。每个点代表一名患者。Western blotting独立重复两次。
图3
图3。对照组和IPF患者肺泡侵入的定量。
(A类)对照组和IPF肺球中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫荧光染色。比例尺：50μm。(B类)游离肺球细胞的FACS分析(n个=7）来自7名对照受试者和9名IPF患者。(C类)与对照组相比，IPF患者肺球中的α-SMA细胞显著增加。数据表示为平均值（误差线）±SD。P（P）=0.005，与对照组相比，双尾未配对学生t吨测试。每个点代表单个主题的值。(D类)侵入三维髓球带（ZOI）的图解和计算。胶原凝胶基质中培养12小时后的髓球示意图：初始髓球用蓝色圆圈圈定，侵入的髓球用覆盖扩张区域的虚线圈定。(E类)量化ZOI的公式。(F类)与对照组相比，髓球中的差异ZOI(n个=9）和IPF患者(n个= 20). 数据以平均值（误差条）±标准差表示。P（P）=0.03，与对照受试者相比，采用Mann-Whitney检验。每个数据点代表每个对照受试者和IPF患者的5个肺球的ZOI%测量值。
图4
图4。通过TGF-β1在对照肺泡和nintedanib在IPF肺泡治疗调节侵袭性。
(A类)对照肺的代表性肺泡未经TGF-β1治疗。比例尺：250μm。(B类)来自9名未经TGF-β1治疗和治疗的对照组的5个肺髓球的计算侵袭区（ZOI）。每个点代表每个对照受试者从5个肺球计算出的ZOI的平均值。数据表示为平均值（误差线）±SD。P（P）=0.002，与对照组（未经处理）相比，双尾配对t吨测试。(C类)IPF患者未经尼替达尼（1μM）治疗12小时的典型相控图像。比例尺：250μm。(D类)未接受尼替达尼治疗和接受尼替达尼治疗的个体患者的pulmospheres侵袭性。每个点代表一个髓球。数据表示为平均值（误差线）±SD。P（P）=0.002，与未经处理的双尾配对肺球相比t吨测试。
图5
图5。暴露于硝苯地平和吡非尼酮后IPF患者的肺泡侵入性差异。
(A类)侵袭区（ZOI）折叠变化的测量值计算为体外抗纤维化药物治疗后ZOI%与未治疗前ZOI%的比值。(B类)ZOI>1的中值表示对治疗无反应的肺泡，而ZOI<1的中值则表示对药物治疗有反应的肺球。对于每个受试患者，在不使用任何一种试验药物的情况下播种5个肺泡；5个纸浆球接种硝苯地平（1μM）；用吡非尼酮（1 mM）接种5个肺球。ZOI倍数变化值是根据每名患者经治疗后的ZOI%与未经体外抗纤维化药物治疗的肺泡ZOI%的比值得出的。IPF患者肺球经(C类)nintedanib和(D类)吡非尼酮。晶须显示最大值至最小值。方框中的行表示中值。方框内的“+”符号表示平均值。
图6
图6。IPF患者肺泡侵袭性与疾病进展的相关性。
(A类)个体患者的临床结果与患者肺泡侵袭性的关系。这8名IPF患者没有服用任何针对IPF的药物。进展型被定义为强迫肺活量（FVC）下降>10%或DL下降的患者合作>12个月内15%或死亡。(B类)患者疾病进展与对硝苯地平和吡非尼酮反应的肺侵犯性之间的关系。五名患者服用硝苯地平，四名患者服用吡非尼酮（红色代表进展，黑色代表非进展。ZOI>1的中值代表对治疗无反应的肺泡，ZOI<1的中值表示对药物治疗有反应的肺球(C类)肺球仅对硝苯地平（绿色）、吡非尼酮（蓝色）、硝苯妥尼或吡非尼酮（灰色）或两者均不反应（红色）的患者数量。(D类)个体患者对硝苯地平和吡非尼酮的反应。患者19对硝苯地平和吡非尼酮都有反应，与吡非尼酮相比，硝苯妥尼对肺泡侵入性的抑制作用更强。13号患者仅对尼替达尼有反应。患者6仅对吡非尼酮有反应。患者14对硝苯地平或吡非尼酮无反应。全部P（P）值，与未经处理的双尾配对的纸浆球相比t吨测试。数据来自每名患者的5个肺泡（未治疗组、尼替达尼治疗组和吡非尼酮治疗组）。“反应”是指与未经治疗的对照组相比，用硝苯地平或吡非尼酮治疗后每个患者肺泡ZOI%的降低。
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