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.2017年9月20日；27(9):550-566.
doi:10.1089/ars.2016.6831。 Epub 2017年7月13日。

线粒体活性氧抑制NFE2L2-抗氧化反应元件通路参与恰加斯病心肌病和左室功能障碍的发生

温建军（Jake Jianjun Wen） 1, 克雷格·波特 2 三, 尼沙·贾恩·加格 1 4 5
附属公司

线粒体活性氧抑制NFE2L2-抗氧化反应元件通路参与恰加斯病心肌病和左室功能障碍的发生

温建军（Jake Jianjun Wen）等。 抗氧化剂氧化还原信号. .

摘要

目的：我们研究了克氏锥虫（Tc）感染期间线粒体活性氧物种（mtROS）对核因子（类红细胞2）2（NFE2L2）转录因子活性的影响，并确定了增强mtROS清除能力是否能保护恰加斯病患者的心脏功能。

结果：感染Tc的C57BL/6野生型（WT，雌性）小鼠表现出线粒体膜电位的心肌损失、复合物II（CII）驱动的耦合呼吸以及线粒体ROS生成的九倍增加。体外和体内研究表明，Tc感染导致ROS依赖性表达、核转位、抗氧化反应元件（ARE）结合和NFE2L2活性下降，抗氧化剂（γ-GCS]、血红素氧化酶-1[HO1]）下降35-99%谷胱甘肽-半胱氨酸连接酶修饰亚单位[GCLM]、硫氧还蛋白（Trx）、谷胱甘苷S转移酶[GST]和NAD（P）H脱氢酶、醌1[NQO1]的表达。在WT.Tc小鼠中观察到心肌和线粒体氧化加合物、心肌室间隔厚度和左心室（LV）重量增加，LV后壁厚度下降，胶原蛋白（COLI/COLIII）、αSMA和SM22α合成不成比例。培养细胞（HeLa或心肌细胞）中锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和锰超氧化物岐化酶的过度表达热重（tg）小鼠保持了NFE2L2转录活性和抗氧化剂/氧化剂平衡，MnSOD显著降低了心脏氧化和纤维化病理热重（tg）.Tc小鼠。重要的是，超声心动图发现WT.Tc小鼠的左室收缩功能（中风量、心输出量、射血分数）和舒张功能（早期/晚期峰值充盈率、心肌性能指数）下降在MnSOD中被消除热重（tg）.Tc小鼠。创新与结论：mtROS抑制NFE2L2/ARE通路是慢性心肌病纤维化基因表达和演变的信号转导的关键机制。保持NFE2L2活性可阻止Chagas病患者的线粒体和心脏氧化应激、心脏纤维化和心力衰竭。抗氧化剂。氧化还原信号。27, 550-566.

关键词：恰加斯病；左室功能障碍；锰超氧化物歧化酶；NFE2L2；克氏锥虫；心脏重塑；线粒体呼吸。

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数字

<b>图1</b>
图1。
现场 慢性感染MnSOD的心脏组织切片线粒体呼吸热重（tg）老鼠。C57BL/6雌性小鼠（WT和MnSOD热重（tg）)被感染了克氏锥虫并在120天pi时收获。心肌纤维束（～2 mg）进行透化，并使用Oxygraph-2k呼吸计测量线粒体呼吸功能。仅用肌纤维束记录基线呼吸，状态4泄漏呼吸（A）记录通过CI底物（丙酮酸+谷氨酸+苹果酸，P+G+M）的电子流支持。然后，ADP-耦合状态3呼吸与来自CI的电子输入（B）已录制。接下来，添加了琥珀酸以记录CI+CII支持的状态3（C）添加鱼藤酮（抑制CI）以记录CII-支持状态3（D）呼吸。通过添加细胞色素c评估线粒体外膜的能力和最大电子传递能力（E）和FCCP（F）分别是。数据绘制为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6-10只小鼠），显著性如下所示*温度控制（Tc）-感染与匹配控件或#重量。Tc与锰超氧化物歧化酶热重（tg）.温度，表示为##第页 < 0.01, ***,###第页 < 0.001之间。用于计算显著性（学生的t吨测试、ANOVA/Tukey’s、Kruskal–Wallis和Dunn’s测试[K-W/Dunn's]以及Mann–Whitney[M-W]）均以图形面板显示。方差分析；CI，复合物I；CII，复合体II；FCCP，羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯基腙；锰超氧化物歧化酶；pi，感染后；SEM，平均值标准误差；温度或T.cruzi公司,克氏锥虫; 野生型野生型。
<b>图2</b>
图2。
MnSOD降低心肌和线粒体抗氧化物/氧化剂失衡和mtROS生成热重（tg）感染小鼠 T.cruzi公司.C57BL/6（WT和MnSOD热重（tg）)小鼠被感染T.cruzi公司并在第4天（早期，Ei）、第30天（急性，Ac）和第150天（慢性，Ch）采集。（A）通过Trolox测定法测定正常和感染小鼠血浆中的总抗氧化能力。（B）慢性感染小鼠的心脏匀浆用于监测H2O（运行）2Amplex Red分析的水平（下一节）和蛋白质羰基（B.B）和脂质过氧化氢（不列颠哥伦比亚省）通过分光光度法测定。（C–F）正常和慢性感染WT和MnSOD的心肌线粒体热重（tg）用差速离心法分离小鼠。心脏线粒体抗氧化能力的分离水平（首席执行官），MnSOD活性（C.b），和蛋白质羰基由蛋白质印迹法测定（D.a、D.b）和分光光度法（数据中心）如图所示。通过CI和CII底物支持分离线粒体中的电子流。图示为线粒体电子泄漏（E.a、E.b）和H的比率2O（运行）2通过Amplex Red分析生产（F.a、F.b）。数据绘制为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6-10只小鼠，每只小鼠观察三次）。重要性如下所示**,##第页 < 0.01，以及***,###第页 < 0.001之间。H（H）2O（运行）2，过氧化氢；线粒体活性氧物种。
<b>图3</b>
图3。
T。 克鲁兹语-MnSOD转染细胞中诱导的活性氧和线粒体缺陷受到控制。用真核表达载体pBI.GFP–MnSOD转染HeLa细胞。（A）相位对比度（A.A）和紫外外荧光（A.b）图像显示，50%以上的HeLa细胞被转染并表达EGFP-linked MnSOD。（B）从正常和pBI细胞中分离出线粒体。GFP–MnSOD转染HeLa细胞。Western blotting显示转染细胞线粒体MnSOD水平升高。（C）正常和表达MnSOD的HeLa细胞与T.cruzi公司24小时的类胰头线虫（细胞与寄生虫比率，1:5） h、 和h2O（运行）2释放通过Amplex红试验测定。（D）将Hela细胞（正常和pBI.GFP–MnSOD转染）接种在96周的平板中，感染T.cruzi公司对于1 h、 清洗以去除游离寄生虫，然后装入TMRE。培养细胞0、3、6、12和24 h.显示了按照材料和方法一节所述监测的TMRE荧光变化（检测线粒体膜电位的变化）。数据绘制为平均值 ± SEM和代表了三个独立实验（每个实验三次观察）。显著性的计算和显示如图1所示，如下所示##第页 < 0.01, ***,###第页 < 0.001之间。TMRE，四甲基罗丹明，乙酯。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图4</b>
图4。
非金融E2乍得心肌L2转录激活(±MnSOD）。小鼠感染了T.cruzi公司收获期为150天。（A）蛋白质印迹。心脏组织匀浆（A.A、A.c）和核部分（A.b、A.d）用抗NFE2L2抗体进行免疫印迹（A.A、A.b）和NFE2L2信号的密度分析（公元前、公元后）显示了。（B）Keap1蛋白的蛋白质印迹和密度测定分析（学士、学士）和HO1（学士、学士）心脏匀浆中的水平。心脏匀浆和核组分WB带的密度分析分别归一化为GAPDH和Lamin A/C。（C）NFE2L2–ARE绑定。WT和MnSOD心脏组织核部分NFE2L2双链DNA结合能力热重（tg）小鼠（±温度)按照“材料和方法”一节中的描述进行测量。（D）WT和MnSOD中γGCS mRNA水平的RT-qPCR分析热重（tg）小鼠（±温度). 数据绘制为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6-10只小鼠）。重要性如下所示***,###第页 < 0.001之间。ARE，抗氧化反应元件；γGCS、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶；HO1、血红素氧化酶-1；Keap1，Kelch-like ECH-associated protein 1；信使核糖核酸；NFE2L2，核因子（红细胞2）样2；RT-qPCR，实时定量聚合酶链反应。
<b>图5：</b>
图5：。
MnSOD保留NFE2L2–ARE功能活性 温度-受感染的细胞。（A）共聚焦显微镜。用空载体转染心肌细胞（A.A–A.f）或pBI.EGFP–MnSOD（A.g–A.l）并与（A.d–A.f，A.j–A.l）或不带（A.A–A.c，A.g–A.i） T.cruzi公司24小时 h.细胞用DAPI染色(核蓝色,A.A、A.d、A.g、A.j）和Alexa Fluor 568-结合抗NFE2L2抗体(红色,A.b、A.e、A.h、A.k)并用共焦荧光显微镜进行分析。覆盖图像（A.c、A.f、A.i、A.l）显示NFE2L2的细胞溶质和核定位。（B）抗氧化基因的表达。RT-qPCR测定（下一节）NFE2L2，（B.B）GCLM公司，（不列颠哥伦比亚省）色氨酸，（下一页）GST，以及（英）MnSOD表达质粒转染心肌细胞中的NQO1并感染T.cruzi公司24小时 h.用GAPDH mRNA对数据进行标准化后，测定折叠变化。（C）NFE2L2转录活性。用pGL3-promo-2x-hHO1瞬时转染HeLa细胞（首席执行官），pGL3-溴-2x-hNQO1（C.b），或pGL3-promo-2x-hGCLM（抄送）由分别来自HO1、NQO1和GCLM的NFE2L2结合ARE序列下的萤光素酶编码基因组成的质粒。用表达MnSOD的质粒和雷尼拉萤光素酶质粒共转染细胞（转染效率标准化的阳性对照）。转染细胞被感染（细胞：温度比例，1:5）24 h.使用双荧光素酶分析测量HO1、NQO1和GCLM的相对NFE2L2转录活性，并将其归一化为Renilla荧光素酶活性。数据（平均值 ± SEM）是三个独立实验的代表（每个实验三次观察）。重要性如下所示*第页 < 0.05, **,##第页 < 0.01, ***,###第页 < 0.001之间。谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基；谷胱甘肽S转移酶；NQO1、NAD（P）H脱氢酶、醌1；Trx，硫氧还蛋白。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图6</b>
图6。
chagasic小鼠的左心室收缩和舒张性能(±MnSOD）。C57BL/6雌性小鼠（WT和MnSOD热重（tg）)被感染了温度所示为经胸超声心动图测量（A）SV，（B）有限公司，（C）EF和（D）≥120天pi时小鼠的ESV。采用脉冲波多普勒超声心动图测量二尖瓣（E）早期和（F）后期峰值速度，（G）IVCT，以及（H）乍得小鼠IVRT。数据绘制为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6-10只小鼠，每只小鼠观察三次）。重要性如下所示##第页 < 0.01，以及***,###第页 < 0.001之间。详细数据见补充表S1。CO，心输出量；EF，射血分数；ESV，收缩末期容积；IVCT，等容收缩时间；IVRT，等容松弛时间；SV，冲程容积。
<b>图7</b>
图7。
乍得小鼠的心脏重塑(±MnSOD）。小鼠（WT和MnSOD热重（tg）)感染情况如图6所示。（A）使用Vevo 2100系统通过超声心动图分析心脏结构变化。显示IVS厚度的收缩（-s）和舒张（-d）值（A.A、A.b），低压区（公元前、公元后），LV质量（A.e），和LVPW厚度（A.f）在慢性感染小鼠中。（B）纤维化评分。慢性感染WT和MnSOD的心脏组织切片热重（tg）用梅森三色染色法对小鼠进行染色，并按照材料和方法部分的描述对组织中的胶原蛋白进行评分。（C）基因表达分析。RT-qPCR用于评估胶原蛋白异型体COLI、COLIII和COLV的mRNA水平（C.a–C.C），αSMA（抄送）和αSM22（抄送）数据绘制为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6-10只小鼠，每只小鼠观察三次）。重要性如下所示**##第页 < 0.01，以及***###第页 < 0.001之间。IVS，室间隔；左心室；LVPW，LV后壁。
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